Système gastrointestinal
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Implication d’une cible thérapeutique dans le développement de la maladie hépatique liée au syndrome métabolique : Preuve de concept après déplétion génétique au niveau du foie dans un nouveau modèle de souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un régime riche en graisses pendant huit ou seize semaines, appliqué pour installer une inflammation puis une fibrose du foie : 60 souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer une protéine dans cet organe vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ne décrit comme atteintes que le stress de deux pesées par semaine et une perte de poids d'environ 5 % la première semaine, alors que la maladie qu'il provoque évolue chez l'humain vers la cirrhose et le cancer du foie. Il revendique un "besoin urgent" d'optimiser le traitement de cette maladie et écrit qu'il serait "intéressant d'affirmer" que sa protéine y joue un rôle. Toutes sont tuées après un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour qu'on collecte leurs tissus.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la Maladie Hépatique Associée au Syndrome Métabolique (MASH). La MASH est caractérisée par une inflammation et une dégradation des cellules hépatiques dues à une accumulation de graisse dans le foie. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, évoluant vers un cancer du foie dans les cas les plus graves. Le Resmetirom, 1er médicament approuvé par la FDA (mars 2024) pour la MASH, permet seulement de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez 24% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser le traitement de la MASH. Au sein de notre laboratoire nous étudions une protéine localisée sur la membrane cellulaire, qui joue un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Il serait maintenant intéressant d’affirmer que cette dernière joue un rôle important dans le développement de la MASH. Pour cela, un nouveau modèle de souris a été développé avec une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’affirmer l’implication de cette dernière sur le développement de la MASH. Afin d’induire un modèle pertinent de MASH avec fibrose hépatique in vivo, un régime spécifique riche en graisses sera appliqué.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre en profondeur le rôle de notre cible thérapeutique dans le développement de la MASH. Par exemple l’étude de son rôle fonctionnelle dans le foie et le métabolisme (réponse au stress oxydatif, inflammation, impact sur la signalisation immunitaire et métabolique) dans le cas de la MASH. Ce modèle avec une suppression ciblées de notre cible permettra de comprendre comment notre protéine d’intérêt participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouveau biomarqueur ainsi que des signatures moléculaires spécifique.
Procédures
Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation (pendant 8 semaine dans un groupe et 16 semaines dans un autre). Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permettra de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement d’une maladie hépatique liée au syndrome métabolique (MASH). Un stress de la souris peut être observé dû à la pesé des animaux 2 fois par semaine. Une légère perte de poids la première semaine du régime est observée (environ -5%).
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie. Les animaux sont observés quotidiennement. A l’arrivé des souris dans l’animalerie, une période d’acclimatations de 7 jours sera appliquée avant le début de la procédure.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une MASH. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).
Importance de l’activité mitochondriale des hépatocytes dans la progression des pathologies du foie liées à un dysfonctionnnement métabolique chez la souris (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
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- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés, chacune passant jusqu'à 24 semaines sous un régime riche en graisse et en sucre. Un lot enchaîne six heures de jeûne, l'administration d'une solution puis cinq à six prélèvements sanguins en deux heures, et 72 heures d'hébergement individuel en cage métabolique. Un troisième lot reçoit un régime conçu pour déclencher une inflammation et une fibrose du foie, alors que le porteur écrit n'attendre l'apparition d'aucun signe clinique. Deux cents autres, réparties en quatre groupes de cinquante, sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil pour qu'on prélève leurs cellules de foie et les mette en culture.
Objectifs
Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) débutent par la stéatose (une accumulation de graisse dans le foie) et peuvent progresser vers la stéato-hépatite (MASH) qui présente un état inflammatoire et un début de fibrose au niveau du tissu hépatique, et ce jusqu’à la fibrose/cirhhose. Au-delà des dysfonctionnements métaboliques du foie, ces pathologies sont également associées à la mortalité d’origine cardiovasculaire et à la survenue de carcinomes hépato-cellulaires. Il est donc important de comprendre les mécanismes qui amènent à leur progression. De nombreuses études soulignent un rôle de l’activité des mitochondries (organites intra-cellulaires entre autres responsables de la production d’énergie) dans le métabolisme du foie et dans la progression des MASLD. Mais la manière dont l’activité mitochondriale est potentiellement responsable de la progression des MASLD n’est pas clairement élucidée. Nous disposons d’un modèle dans lequel l’absence d’une protéine située au niveau de la membrane des mitochondries dans les hépatocytes de souris mâles a la capacité d’intensifier le processus de respiration mitochondriale couplée à la production d’énergie dans ces cellules et est corrélée avec une protection de ces animaux vis-à-vis de l’apparition d’une stéatose induite par un régime riche en graisse. Notre objectif est à présent de vérifier si ces résultats, initialement obtenus chez des mâles, peuvent également être confirmés chez des souris femelles, ce qui nous parait particulièrement important dans un contexte clinique où la survenue des MASLD a une fréquence différente en fonction du sexe des patients. Nous cherchons également à déterminer si une modulation de l’activité respiratoire mitochondriale, une fois la stéatose hépatique installée, a des vertus curatives, ce qui permettra d’envisager des voies thérapeutiques dans l’avenir. Enfin nous souhaitons déterminer si cette modulation de l’activité respiratoire mitochondriale a des vertus préventives également vis-à-vis de la progression de la stéatose en MASH. Enfin nous utiliserons des hépatocytes primaires en culture, afin d’élucider les mécanismes à l’origine des observations effectuées in vivo.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de notre protéine d'intérêt pour la fonction du foie. Ils permettront également de mettre en évidence des différences de réponses cellulaires entre mâles et femelles vis-à-vis de la progression des MASLD (maladies du foie liées à un dysfonctionnement métabolique), en particulier comment survient l’apparition d’un foie dit gras et comment cela peut évoluer en un foie inflammé et fibrosé . Nous résultats pourraient également permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant les mitochondries, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des maladies métaboliques et hépatiques chez les patients.
Procédures
(MODIFICATION) Un premier lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse et en sucre (animal vigile, 24 semaines), période au cours de laquelle une moitié d’entre eux sera soumise à deux tests métaboliques pendant que l’autre moitié sera soumise à un test métabolique et à une mesure de la dépense énergétique. Les tests métaboliques sont tous précédés d’une mise à jeun de 6h et sont constitués d’une administration d’une solution (animal vigile, 5 sec, 1 fois), suivie de 5 à 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h. La mesure de la dépense énergétique implique un hébergement individuel temporaire (animal vigile, 72h). En fin de procédure, tous les animaux de ce premier lot seront soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois) pour la mesure de leurs paramètres biochimiques. Un second lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin (animal vigile, 30 sec, 1 fois), à une injection intra-veineuse (animal anesthésié, 30 sec, 1 fois), et à un hébergement individuel (animal vigile, 72h). En fin de procédure, chacun des animaux du lot sera soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Un troisième lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse capable d’induire une inflammation et une légère fibrose du foie (animal vigile, 16 semaines). Il sera également soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Enfin un quatrième lot d’animaux sera soumis à une procédure chirurgicale sans réveil (animaux sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois 20 min). (MODIFICATION) Une modification de projet sans augmentation du nombre d'animaux est nécessaire car un régime alimentaire induisant une obésité et une résistance à l'insuline est remplacé par un régime entrainant une maladie du foie en plus de ces syndrômes métaboliques.
Impact sur les animaux
(MODIFICATION) Les régimes spéciaux peuvent engendrer une maladie du foie, de l'obésité et une résistance à l'insuline ce qui peut induire une douleur modérée, une modification de leur déplacement et de leur mobilité. Les tests métaboliques peuvent entrainer des hyper ou hypoglycémies transitoires chez les souris. L'hébergement individuel de courte durée en cage métabolique peut induire un stress chez les animaux. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses peuvent engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. Enfin, les procédures d’anesthésie peuvent engendrer un risque cardio-respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour des analyses post-mortem. Concernant les 3 premiers lots d’animaux, les foies entiers seront collectés et leur analyse nous permettra d’évaluer la santé du foie en réponse aux différents régimes alimentaires et aux traitements à visée curative. Concernant le quatrième lot, une procédure chirurgicale sans réveil, réalisée sous anesthésie et analgésie, nous permettra d’isoler les cellules du foie pour effectuer des analyses plus poussées sur le fonctionnement de ces cellules, en présence ou absence de notre protéine d’intérêt. Ces résultats complémentaires devraient nous permettre d’expliquer les différents états de santé du foie observés chez les animaux.
Remplacement
Selon la règle des 3R, la caractérisation de notre protéine d'intérêt a d’abord été réalisée in vitro et dans un modèle invertébré. Ces modèles n’étant pas basés sur des pathologies des grands systèmes chez l’humain, ils ne permettent pas d’étudier son importance in vivo. Certaines questions d'intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que nous réalisions des expériences sur les hépatocytes primaires de souris maintenus en culture, ainsi que l’exploration de certains mécanismes par simulation informatique, nous ne pouvons pas étudier la physiopathologie des maladies mitochondriales ex vivo car les phénomènes sont multifactoriels. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer in vivo au cours de plusieurs mois le développement des altérations pathologiques propres aux organes en question.
Réduction
408 animaux seront utilisés pour ce projet. L’utilisation de souris génétiquement modifiées permettra de démontrer l’importance hépatique de notre protéine d'intérêt et son rôle potentiel dans la progression des maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD pour metabolic-associated steatotic liver disease) à la fois chez les mâles et femelles. Pour chaque condition de régimes, des groupes de 8 à 10 souris seront créés afin d’obtenir une puissance satisfaisante à la fin de l’étude pour des résultats significatifs. Pour l’isolement d’hépatocytes et leur mise en culture, 4 groupes de 50 animaux seront nécessaires afin de reproduire de manière fiable une variété d’expériences en culture cellulaire.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventiles avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et sont habitués à être manipulés avec un suivi de poids hebdomadaire qui permet de s’assurer du bon état de santé des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Nous n’attendons l’apparition d’aucun signe clinique. En particulier, les régimes alimentaires, déjà testés par notre équipe, ont été développés en vue de circonvenir aux effets délétères des précédents régimes qui engendraient d’importantes pertes de poids chez les animaux. Néanmoins, nous veillerons à détecter les premiers signes de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité qui pourraient être induits : respiratoire, abattement, perte de poids, dysfonctionnement hépatique. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les prélèvements sanguins et les injections seront réalisés sous anesthésie locale ou générale. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie/analgésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à deux considérations : 1) tous les gènes de la dynamique mitochondriale sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations. Les modèles murins proposés présentent plusieurs avantages notamment la possibilité d’étudier le fonctionnement du foie dans un contexte physiologique où il communique avec tous les organes ainsi que d’étudier la réponse du foie et de l’organisme aux stress hépatiques comme la fibrose hépatique dans le cadre des MASLD (maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique) et le diabète. Les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l’âge adulte de 8-10 semaines pour ne pas interférer avec leur développement.
Utilisation de l’IRM pour une étude de morphométrie du système digestif dans un modèle de Maladie de Crohn
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après douze à quatorze heures de jeûne, un produit irritant leur est administré directement dans le côlon pour provoquer une inflammation de trois jours, avec une perte de poids attendue pouvant approcher 20 %, puis ils passent une IRM sous anesthésie avant d'être tués par injection létale. L'objet est de savoir si l'IRM permet de mesurer l'épaississement de la paroi du côlon, en vue d'études ultérieures sur l'effet des polluants. Le porteur qualifie les six animaux par groupe d'"indispensables" pour compenser les différences individuelles, sans autre calcul, cette étude préliminaire devant précisément servir à dimensionner les suivantes.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. Pour comprendre l’effet de certains polluants sur l’inflammation de l’intestin, notre projet recherche de nouveaux outils permettant de suivre l’évolution et l’étendue de l’inflammation en utilisant des outils capables de mesurer précisément l’ampleur de cette inflammation, notamment en observant l’épaississement de la paroi du côlon. D'autres segments du tube digestif pourront également être explorés. Nous n'avons jusqu'à présent pas une notion suffisante de la capacité de résolution et de la précision de l'outil IRM pour réaliser une mesure précise de l'épaisseur de la paroi intestinale. Ce projet a ainsi pour ambition de lever cette incertitude.
Bénéfices attendus
Afin de répondre à un certain nombre de questionnements sur l'implication de ces polluants environnementaux dans le développement et la modulation de l'inflammation, nous cherchons des outils matériels pertinents qui permettraient de mesurer l'étendue de l'inflammation notamment de l'infiltration inflammatoire par la mesure de l'épaisseur des couches de la paroi colique. Nous savons qu'au cours du développement de la phase inflammatoire, l'infiltrat de cellules inflammatoires va épaissir progressivement la paroi du tissu d'intérêt. Grâce à l’imagerie par résonance magnétique, il est possible d’obtenir des informations très utiles pour mesurer ces changements sans avoir besoin de sacrifier l’animal à chaque étape. Cela permet de suivre l’évolution de l’inflammation chez le même animal à plusieurs moments, selon le traitement reçu. Cette approche aide à mieux comprendre le phénomène tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences futures.
Procédures
Dans ce projet, une inflammation contrôlée du colon est provoquée chez les rats en administrant un produit irritant directement dans le côlon, après une période de jeûne de 12 à 14 heures. Cette inflammation, modérée et de courte durée (3 jours), est conçue pour limiter au maximum les effets négatifs sur les animaux. Une perte de poids modérée, inférieure à 20%, peut survenir au cours des deux premiers jours. À la fin des trois jours, les animaux sont placés sous anesthésie gazeuse pour passer par l’imagerie par résonance magnétique, puis endormis avant mise à mort afin de permettre des prélèvements et analyses de tissus.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé dans cette étude provoque une inflammation très modérée du côlon chez les rats. De notre expérience du modèle, on attend une perte de poids modérée au cours des deux premiers jours, sans autres changements détectables de comportement. L’injection du produit qui déclenche l’inflammation dure environ deux minutes et se fait sous anesthésie générale. Pour éviter que les animaux ne prennent froid pendant l’anesthésie, ils sont installés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Ensuite, chaque rat retourne dans sa cage, où il est régulièrement surveillé pendant 6 heures après la procédure pour s’assurer de son bon état de santé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par administration létale d'anesthésique après la session de passage à l'IRM, afin de réaliser les prélèvements tissulaires et analyses ultérieures.
Remplacement
L’utilisation de rats dans ce projet se justifie parce qu’il n’existe pas d’autres modèles capables de mimer fidèlement les phénomènes étudiés, comme l’inflammation de l’intestin ou le comportement des animaux. Les modèles utilisant uniquement des cellules, des simulations informatiques ou des petits organismes comme les vers ou les insectes ne sont pas adaptés pour reproduire les interactions complexes entre les différents organes comme l’intestin, le microbiote, le cerveau ou le foie. De plus, certains effets de l’inflammation, par exemple l’augmentation de la température corporelle, ne peuvent être étudiés que chez un organisme vivant qui peut s’adapter, notamment par des changements dans le sommeil ou l’alimentation. Les jeunes rats offrent aussi un modèle pertinent, reproductible et validé dans la communauté scientifique.
Réduction
Cette étude est une étude préliminaire. Nous prévoyons d’utiliser 12 rats, répartis en deux groupes de 6. Ce faible nombre nous permet d’obtenir les premiers résultats qui serviront de base s’ils sont positifs pour calculer au plus juste le nombre de rats nécessaires pour une étude plus importante. C’est pourquoi dans cet esprit de réduction nous choisissons uniquement de jeunes mâles adultes pour limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Avoir 6 animaux par groupe est indispensable pour compenser les différences individuelles et obtenir des résultats fiables sur le plan statistique.
Raffinement
Afin de limiter l’inconfort des animaux, toutes les manipulations pouvant causer un stress ou une douleur, comme l’injection dans le côlon ou l’imagerie par résonance magnétique, seront réalisées sous anesthésie générale. Les rats seront hébergés dans des cages spacieuses au sein d’un environnement adapté (endroit calme et climatisé) où ils pourront bouger librement, se redresser et s’allonger, afin de préserver leur comportement habituel. Plusieurs éléments favorisant leur bien-être seront ajoutés : les rats seront hébergés en petits groupes stables pour maintenir une vie sociale, des objets qu’ils peuvent manipuler seront mis à leur disposition (comme des tubes en carton ou des frisettes), et un fond musical varié sera diffusé. Enfin, les cages transparentes permettront une bonne visibilité et un environnement visuel stimulant.
Choix des espèces
Pour cette étude, nous émettons l’hypothèse que l’exposition aux polluants pendant les phases sensibles du développement, comme l’enfance et l’adolescence, pourrait favoriser la survenue de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. C’est pourquoi nous utilisons des rats jeunes adultes car ils réagissent physiologiquement et comportementalement de manière proche des humains face à différents polluants environnementaux. Ce modèle est reconnu scientifiquement pour l’étude de l’inflammation intestinale et les installations nécessaires à leur hébergement sont bien adaptées depuis plusieurs années.
Traitement anticancéreux Activé par Rayonnements Ionisants appliqué aux Tumeurs Solides
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- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau ou directement dans le pancréas au cours d'une opération de quarante-cinq minutes, puis elles passent des séances d'IRM d'une heure et de TEP sous anesthésie avant d'être irradiées. Le porteur décrit une tumeur pancréatique qui peut gêner la prise alimentaire, une tumeur sous-cutanée qui peut se nécroser et entraver la marche, et annonce une preuve de concept transférable en clinique. Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort immédiatement, et les tumeurs sous-cutanées sont mesurées au pied à coulisse deux fois par semaine pour surveiller le volume à partir duquel l'animal sera tué.
Objectifs
L’un des objectifs majeurs de la recherche en cancérologie est l’amélioration de l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette amélioration combine un meilleur ciblage de la tumeur avec une meilleure efficacité tout en limitant les dommages qu’ils peuvent causer au tissu sain (effets secondaires). Un des axes de recherche développé dans cet objectif est la fabrication de composés théranostiques (qui provient de la contraction des mots thérapie et diagnostic). Ces composés moléculaires permettent la cartographie des cellules cancéreuses dans le corps et leur traitement de façon ciblée. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des composés chimiques en cours de validation in vitro (toxicité, activation par les radiations ionisantes). Les composés les plus prometteurs, une fois injectés, sont détectés par des techniques d’imagerie (cartographie de la tumeur) puis activés par radiothérapie de façon à induire les effets thérapeutiques souhaités, tels que la destruction des cellules cancéreuses, l’activation du système immunitaire, etc ... L’action thérapeutique est donc contrôlée de façon à limiter l’impact sur les tissus sains et les effets secondaires associés à une chimiothérapie classique. Dans ce projet nous nous intéresserons particulièrement à des tumeurs solides du pancréas dont les traitements actuels sont peu efficaces. L’objectif de ce projet est donc d’étudier la biodistribution de nos composés théranostiques les plus prometteurs, de déterminer l’efficacité de leur effet thérapeutique sous radiothérapie dans des modèles de cancers du pancréas chez la souris avec pour finalité une utilisation dans le domaine clinique.
Bénéfices attendus
La grande majorité des composés activables par stimulations externes actuellement décrits dans la littérature ne permettent pas une application dans le domaine clinique. Notre projet vise à combler ce manque en caractérisant des composés théranostiques développés pour une application clinique. Ces composés représentent un outil innovant dans la recherche en cancérologie, car ils permettent à la fois une visualisation de la tumeur et une amélioration de l’efficacité de la radiothérapie. Si la preuve de concept se fera sur des tumeurs du pancréas, la non-spécificité de nos molécules pour un type de cancer donné ouvre la perspective d’une application à d’autres types de tumeurs solides. A court terme, ce projet permettra de valider ce concept innovant de traitement qui pourra par la suite être transféré en clinique.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales pancréatiques seront injectées en sous-cutané (durée du geste inf à 10 sec) ou dans le pancréas de souris placés sous anesthésie générale, analgésiques et antalgiques (durée du geste 45 min). La croissance des tumeurs est observée via des imageries de bioluminescence réalisées au maximum toutes les semaines (durée de l’acquisition d’image : 1 min, avec les animaux sous anesthésie générale gazeuse). Dans un second lot d’animaux sains, la toxicité des composés sera étudiée. Plusieurs formulations de composés à différentes concentrations seront injectées aux souris saines par plusieurs voies d’administrations (durée des injections inférieur à 1 min par animal, réalisé une seule fois). Dans un troisième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, des imageries seront réalisés (IRM : réalisé une seule fois, durée d’une heure par animal sous anesthésie générale gazeuse ; TEP : réalisé plusieurs fois si nécessaire avec un délai minimal de 15 jours entre chaque imagerie, durée de 10min par animal sous anesthésie générale gazeuse) afin de visualiser l’anatomie de la tumeur et caractériser son activité métabolique. Ensuite, nous ferons de prélèvements d’organes afin de doser la quantité de composé accumulée dans les organes vitaux. Dans un quatrième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, plusieurs doses d’irradiation seront testées sur différents animaux afin de vérifier la dose la plus appropriée pour nos futurs traitements (durée d’irradiation de 15 min maximum par animal, sous anesthésie générale gazeuse). Dans un cinquième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, les composés seront injectés (la formulation, la concentration et la voie d’administration seront choisies en fonction des résultats obtenus sur le 2ème lot d’animaux, la durée des injections reste inférieur à 1 min par animal) puis un traitement par radiothérapie sera réalisé (la dose d’irradiation sera choisie en fonction des résultats obtenus sur le 3ème lot d’animaux, avec une durée d’irradiation de 15 min maximum par animal). Nous étudierons ainsi l’efficacité de nos composés sur les tumeurs pancréatiques.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales comprenant des implantations tumorales peuvent occasionner des douleurs. Le développement tumoral dans le pancréas peut engendrer des difficultés dans la prise alimentaire ou encore une perte de poids. Le développement tumoral sous-cutané peut engendrer de la nécrose ou une gêne lors de certains mouvements, notamment pour la locomotion. Lors des tests de toxicité, une perte de poids peut être observée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour les analyses post-mortem
Remplacement
Avant toute étude chez l’animal, les composés théranostiques (famille appelée radioswitch) ont subi de nombreux tests préliminaires in vitro., notamment pour valider leur capacité à se fixer sur leurs cibles présentes à la surface des cellules tumorales. Ces travaux ont montré des résultats très concluants in vitro, qui nécessitent à présent d’être confirmés in vivo. En effet, il s’agit d’étudier la capacité de ces composés à se fixer sur leurs cibles lorsque les cellules tumorales sont présentes dans un organisme et également à délivrer après activation un signal conduisant à la mort de la cellule (directement ou bien grâce à l’intervention du système immunitaire)
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un test logrank sur logiciel G*power.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Pour limiter la souffrance des animaux, la procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec recours aux anesthésiques locaux et aux analgésiques. Les animaux sont également observés après les greffes afin de détecter tout signe de souffrance ou de mal être. Les animaux sont observés quotidiennement et pesés 5 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant les chirurgies. Puis, les animaux sont observés et pesés 3 fois par semaine afin de détecter tout signe de mal être ou de détérioration de leur état durant le développement des tumeurs. Si une souris présente une perte de poids de 20% par rapport à son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Les tumeurs en sous-cutanée, sont mesurées au pied à coulisse au minimum 2 fois par semaine afin de suivre leur vitesse de pousse. Nous serons particulièrement attentifs à l’atteinte du point limite éthique lié au volume de la tumeur selon le site d’implantation. Pour les tests de toxicité, les animaux sont observés et pesés 7 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant l’injection des composés, puis ils sont pesés 3 fois par semaine. Si les animaux présentent des effets secondaires suite à l’injection des composés, les symptômes seront identifiés et traités de façon adéquat. Les irradiations ne sont pas douloureuses et sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements de l’animal. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Nous serons attentifs à tout signe de mal-être tel que décrit dans la grille de score et prendrons les mesures adéquates pour arrêter la souffrance de l’animal notamment la mise en place de soins de support. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de biodistribution / biopharmacocinétique et de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique largement utilisé pour les études impliquant des molécules et/ou de la radiothérapie ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes car les tumeurs du pancréas chez l’homme touchent quasi exclusivement l’adulte.. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7/8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats Des animaux adultes et ayant fini leur développement sont nécessaires auquel cas, lors des implantations, les tumeurs pourraient migrer et nos études seraient alors inexploitable.
MODIFICATION: Gestion de la production d’animaux qui développent spontanément une colite chronique et collecte de lait de mère.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Porteuses d'une mutation qui les prive d'une protéine anti-inflammatoire, ces souris développent d'elles-mêmes une inflammation chronique de l'intestin, avec diarrhées, déshydratation et perte de poids pouvant atteindre 20 %. 1 250 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mères allaitantes sont endormies, reçoivent une injection d'ocytocine et sont séparées de leurs petits pendant deux à quatre heures pour que leur lait soit collecté et analysé. Le porteur indique que 820 souris passeront dans d'autres procédures, les autres étant tuées à l'apparition de signes de souffrance, faute de portée depuis deux mois, ou à vingt-quatre semaines parce qu'elles sont alors jugées trop âgées.
Objectifs
Ce projet porte sur l’élevage et l’observation d’une lignée de souris qui, avec le temps, développe naturellement une inflammation chronique de l’intestin, appelée colite. Cette maladie chez la souris est utilisée comme modèle pour mieux comprendre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) chez l’être humain, comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Ces maladies touchent de plus en plus de personnes et sont liées à un déséquilibre complexe entre notre système immunitaire, notre environnement et les milliards de bactéries vivant dans nos intestins (appelées le microbiote). Dans cette étude, nous utilisons une lignée de souris porteuse d’une mutation dans un gène important pour contrôler l’inflammation (le gène IL-10). Ces souris développent spontanément des signes de maladie intestinale, ce qui en fait un bon modèle d’étude pour les MICI. Il est connu que la composition du microbiote a un rôle déterminant dans le déclenchement ou l’aggravation de la maladie chez ces animaux. L’un des objectifs de ce projet est de décrire les conditions d’élevage et les soins apportés à ces souris sensibles, afin d’assurer leur bien-être tout en permettant l’observation des signes de la maladie. MODIFICATION: Un autre objectif est de collecter du lait maternel chez des souris malades et des souris en bonne santé, pour analyser sa composition. À terme, ce modèle permettra de mieux comprendre comment certains composants du lait maternel peuvent influencer la santé intestinale des nouveau-nés, et comment cela pourrait prévenir ou aggraver les maladies comme les MICI. Ce projet vise également à tester de nouvelles approches thérapeutiques, notamment basées sur de petites molécules naturelles appelées micro-ARN, connues pour réguler de nombreux mécanismes biologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de maintenir et d’utiliser une lignée spécifique de souris (appelées souris IL10-KO) qui développent naturellement une inflammation intestinale, afin de soutenir nos recherches, ainsi que celles de nos partenaires, sur les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ces souris sont essentielles pour tester des hypothèses sur l’origine et le développement de ces maladies. MODIFICATION: Une autre partie importante du projet consiste à collecter du lait maternel chez les mères souris, utilisées pour le maintien de la lignée, ce qui nous permettra d’analyser sa composition et de voir s’il existe un lien avec l’état de santé des petits. Cela nous aidera à comprendre si certains composants du lait influencent la survenue ou la gravité des maladies intestinales plus tard dans la vie. Grâce à ce modèle, nous espérons mieux comprendre comment ces maladies se développent dès les premiers jours de vie. Ce travail pourrait mener à l’identification de nouveaux signes précoces (biomarqueurs) de la maladie, mais aussi de nouvelles cibles pour des traitements plus efficaces. Enfin, ces souris nous permettront de tester de nouvelles molécules anti-inflammatoires et de les comparer aux traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de MICI, dans le but d’améliorer les options thérapeutiques à l’avenir.
Procédures
MODIFICATION: Du lait sera collecté chez les mères allaitantes, ce qui nécessite deux étapes : une injection d’ocytocine (une hormone qui stimule la lactation), geste qui dure environ 10 secondes, et une séparation temporaire des petits pendant deux à quatre heures avant la collecte.
Impact sur les animaux
Certaines souris utilisées dans ce projet, appelées souris IL10-KO, peuvent développer naturellement, au fil du temps, une inflammation chronique de l’intestin. Cette maladie peut provoquer des diarrhées importantes, une déshydratation, ainsi qu’une perte de poids rapide pouvant atteindre 20 % du poids initial. Dans ces cas, l’expérimentation sera arrêtée pour ces souris afin d’éviter toute souffrance excessive. D’après nos observations précédentes, environ 85 % des femelles et 90 % des mâles atteignent l’âge de 14 semaines sans complication majeure. MODIFICATION: Par ailleurs, nous prévoyons de collecter du lait chez les mères allaitantes, ce qui nécessite deux étapes : une injection d’ocytocine (une hormone qui stimule la lactation), et une séparation temporaire des petits pendant deux à quatre heures avant la collecte. Il est connu que ces manipulations peuvent entraîner un léger stress chez la mère, mais les injections sont rapides, réalisées avec soin, et les souriceaux sont suffisamment grands (entre 14 et 16 jours après la naissance), ce qui réduit considérablement les risques de comportements anormaux, comme le rejet ou le cannibalisme. L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les nuisances et garantir le bien-être des animaux tout au long du projet.
Devenir
Les souris générées dans ce projet seront soit intégrés dans un protocole expérimental dès 4 semaines de vie, soit gardés en vie pour la gestion des accouplements, soit euthanasiés lorsqu'elles présenteront des signes de souffrance ou lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois ou âgées de 24 semaines (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche). Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont très complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le système immunitaire, les microbes intestinaux, la génétique et l’environnement. Ces maladies affectent non seulement l’intestin mais aussi d’autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement et les microbes interagissent avec l’organisme, les souris sont le modèle le plus adapté. À ce jour, il est impossible de recréer ces interactions complexes en laboratoire uniquement avec des cellules.
Réduction
Nous ajusterons l’élevage des souris en fonction des besoins de recherche de l’équipe de recherche. Ayant une connaissance approfondie de cette lignée (son mode de reproduction, le nombre et la taille des portées), nous sommes en mesure de gérer l’élevage de manière efficace et raisonnée. Concrètement, nous maintenons en permanence deux couples reproducteurs pour assurer la continuité de la lignée. Si une expérience spécifique est prévue et approuvée, nous augmentons temporairement le nombre de souris pour répondre aux besoins de l’étude. MODIFICATION: La collecte de lait chez les mères est réalisée au moment même où ces femelles sont utilisées pour maintenir la lignée, ce qui évite d’ajouter de nouvelles souris uniquement pour cette procédure. Cela contribue à réduire le nombre total d’animaux utilisés, tout en obtenant les échantillons nécessaires pour nos recherches.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’élevage, les souris seront surveillées chaque jour par du personnel qualifié et formé au bien-être animal. Certaines souris de cette lignée peuvent développer une inflammation intestinale appelée colite, qui sera suivie avec attention. Un système de suivi basé sur une grille d’évaluation standardisée permettra de repérer les premiers signes de cette inflammation. Cette grille prend en compte plusieurs éléments comme la perte de poids, l’aspect extérieur, les selles ou encore le comportement général de la souris. En fonction de cette évaluation, des mesures adaptées seront prises : - Si les signes s’aggravent, la fréquence des contrôles sera augmentée. - Si les animaux montrent des signes de déshydratation ou de perte de poids, ils auront accès à une gelée de réhydratation dans leur cage. - Si les signes deviennent trop importants, l’expérience sera arrêtée pour l’animal concerné, afin d’éviter toute souffrance. MODIFICATION: Concernant la collecte de lait, cette procédure est également soigneusement encadrée : - La mère est endormie brièvement et en douceur à l’aide d’un gaz anesthésiant (isoflurane). - Une injection d’ocytocine, une hormone naturelle, est réalisée pour faciliter l’expulsion du lait. L’injection est faite de manière rapide, précise, et par du personnel expérimenté. - Les petits sont temporairement séparés de leur mère pendant 2 à 4 heures, ce qui est bien en dessous de la durée habituellement utilisée pour ce type de procédure (généralement 6 à 12 heures). Durant cette séparation, les petits restent confortablement installés dans leur nid d’origine dans une boîte aérée et sécurisée. De plus, le volume de liquide injecté à la mère est supérieur à celui du lait prélevé, ce qui permet de préserver son hydratation. L’ensemble de ces gestes est maîtrisé par les expérimentateurs et a été optimisé pour limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Si, malgré ces précautions, un animal montre des signes de souffrance, les expériences seront adaptées, atténuées ou même suspendues si nécessaire. Enfin, l’environnement des souris sera enrichi (avec du coton, des abris, un cycle jour/nuit respecté) afin de favoriser des comportements naturels et réduire le stress.
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’intestin lui-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entrainant ainsi une inflammation intestinale ressemblant à une colite hémorragique chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris pourront commencer à se reproduire dès l’âge de 5 semaines, qui correspond à leur maturité sexuelle.
Etude de la réponse immunitaire adaptative dans un modèle murin de colite
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Croisées pour être dépourvues de lymphocytes T et B tout en développant une colite chronique à partir de huit semaines, les souris de ce projet sont 1 764, dont 1 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une bague auriculaire et une biopsie de la queue pour le génotypage, et plusieurs centaines subissent des injections répétées de sérum, d'anticorps ou de cellules, avec prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur indique que l'inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou un prolapsus rectal, et que certains traitements testés pourraient l'aggraver. Les souris gardées pour la reproduction sont tuées à huit mois pour renouveler les accouplements, celles dont le génotype ne convient pas à six semaines.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies qui se traduisent par une inflammation durable du côlon, dont les causes exactes restent encore mal connues. Le système immunitaire pourrait jouer différents rôles dans ce contexte : il pourrait être responsable d’une réaction excessive contre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin, mais aussi, au contraire, contribuer à limiter leur passage dans les tissus lésés et à réguler l’intensité de l’inflammation. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires, en particulier des lymphocytes T et B, dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale. Pour cela, nous allons créer un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées. Objectif 1 : Développer des modèles de souris qui présentent une colite avec ou sans système immunitaire adaptatif. Cela permettra de comparer directement l’influence de ce système sur la maladie. Chez les animaux dépourvus de ce type de défense, il sera possible de réintroduire des éléments du système immunitaire (anticorps ou cellules) afin d’évaluer leur rôle. Objectif 2 : Étudier plus particulièrement le rôle des anticorps dans le développement de la colite et tester l’effet de traitements basés sur leur administration. Pour cela, des souris dépourvues de réponse immunitaire adaptative seront reconstituées avec différents composants issus d’animaux immunocompétents, et l’effet de l’injection d’anticorps sera analysé selon différents modes d’administration. Objectif 3 : Évaluer l’impact d’une réponse immunitaire dirigée contre les bactéries intestinales. L’expérience consistera à stimuler le système immunitaire des souris avec des éléments du microbiote afin de voir comment cela influence l’évolution de la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre le rôle du système immunitaire adaptatif dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin à travers la réalisation et l’exploitation d’un nouveau modèle expérimental murin. Ce modèle servira aussi à explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Par exemple, nous évaluerons l’effet de l’injection d’anticorps humains déjà utilisés en clinique dans d’autres maladies, afin de voir s’ils limitent le passage des bactéries et l’inflammation intestinale. Nous comparerons aussi leur efficacité selon différentes modalités d’administration. Enfin, nous testerons une stratégie vaccinale innovante visant à “éduquer” le système immunitaire contre des composants bactériens, dans l’objectif de réduire l’inflammation et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou de futurs marqueurs biologiques utiles pour le suivi des MICI.
Procédures
Tous les animaux (1764 souris) auront une bague auriculaire et une unique biopsie caudale pour le génotypage. Ces gestes, très courts (quelques secondes) sont réalisés sur animal vigile. Quatre-vingts souris recevront deux injections de sérum à 7 jours d’intervalle sous anesthésie légère. L’injection dure environ 5 minutes. Cent-vingt autres souris recevront pendant 5 jours consécutifs une injection d’anticorps sans anesthésie. Chaque injection dure 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés chez ces animaux vigiles. Ce type de prélèvement dure 5 minutes au maximum. Une injection de cellules sera réalisée sur 140 autres animaux légèrement anesthésiés. Un prélèvement sanguin sera aussi réalisé sur ces mêmes animaux vigiles. Deux cents autres souris recevront 3 injections de 200µl de composés à 4, 6 et 8 semaines de vie. Ces injections se feront sur animaux vigiles et durent 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés avant l’immunisation et 1 semaine après la dernière injection chez tous ces animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris dépourvues de défenses immunitaires présentent un risque accru d’infections. Toutefois, elles seront élevées dans des conditions protégées et conformes à la réglementation, dans un environnement exempt de pathogènes, ce qui limite fortement ce risque et ne provoque pas de souffrance particulière dans ces conditions. En revanche, les souris utilisées pour mimer la maladie développent une colite chronique à partir d’environ 8 semaines d’âge. Cette inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou, plus rarement, un prolapsus rectal. Dans ces cas, les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections nécessaires au projet durent moins de 5 minutes et n’entraînent qu’une gêne légère et transitoire liée à la piqûre. Les traitements dureront de 10 jours à 16 semaines en fonction des procédures appliquées. Certains traitements testés pourraient améliorer l’inflammation, tandis que d’autres pourraient l’aggraver en accélérant son apparition et/ou en augmentant son intensité. Pour cette raison, les animaux recevant un traitement feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’intervenir en conséquence.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 5 « génotypage » restent en vie à l’issue de la procédure. A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux ayant le génotype d’intérêt serviront pour la reproduction et l’entretien des lignées et pour certaines autres procédures. Les animaux en reproduction seront euthanasiés à l’âge de 8 mois afin de renouveler les accouplements. Les animaux de génotype inadéquats, donc inutilisables, seront euthanasiés à 6 semaines. Les animaux des autres procédures seront euthanasiés à la fin de l’étude pour réaliser les prélèvements.
Remplacement
Le système immunitaire adaptatif est un processus complexe impliquant différents types de cellules (par exemple, les lymphocytes T et B) qui interagissent entre elles et avec d’autres cellules pour déclencher ou réguler l’inflammation. Dans les maladies intestinales, cette inflammation résulte aussi de relations encore mal connues entre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin (le microbiote), les cellules de la paroi intestinale et les défenses immunitaires. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites uniquement par des expériences en laboratoire sur cellules isolées ou par des modèles informatiques. La création d’une nouvelle lignée de souris combinant deux modèles existants offrira donc une opportunité unique pour analyser plus en détail le rôle du système immunitaire adaptatif dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une gestion rigoureuse des programmes de reproduction. Les croisements seront organisés de manière à obtenir prioritairement les génotypes utiles pour les expériences, tout en réduisant au maximum la naissance d’animaux porteurs de caractéristiques susceptibles d’altérer leur bien-être. Une attention particulière sera portée au suivi des nouveaux génotypes afin d’évaluer précocement leur état de santé et leur qualité de vie, conformément aux recommandations européennes. Pour les expériences, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 10. Ce choix correspond aux standards de la littérature scientifique et permet de tenir compte de la variabilité biologique naturelle, tout en garantissant une solidité statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Cette approche évite de multiplier inutilement le nombre d’animaux en cas d’études inconcluantes, et respecte ainsi le principe de réduction parmi les 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer).
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués progressivement à l’expérimentateur, grâce à une routine d’élevage et à des manipulations douces et régulières, afin de réduire leur stress. Leur hébergement sera enrichi de matériel pour la construction de nids, favorisant leur confort. L’élevage sera maintenu à l’état hétérozygote pour limiter l’apparition d’animaux présentant des caractéristiques potentiellement dommageables. Pour les souris immunodéficientes, un environnement protégé et conforme à la réglementation sera assuré. Les cages seront changées dans des conditions stériles afin de réduire le risque de contact avec des agents infectieux. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés pour garantir le maintien de ces conditions sécurisées. Chez les animaux développant une colite, une surveillance quotidienne sera effectuée par du personnel formé, avec une pesée bihebdomadaire et une observation attentive des signes cliniques (perte de poids, modifications du comportement, état du pelage, posture, cris ou blessures). Les cages de ces animaux présentant une colite seront nettoyées plus fréquemment pour préserver leur confort. Si des signes de souffrance apparaissent, des mesures adaptées de prise en charge de la douleur seront mises en place. En cas de mauvaise tolérance ou de souffrance importante, le protocole expérimental sera interrompu, et les animaux concernés seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car ses mécanismes immunitaires sont très proches de ceux de l’Homme. De plus, des lignées génétiquement modifiées ciblant des gènes clés impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et dans le développement de l’inflammation intestinale sont disponibles. Le croisement de ces deux lignées permettra d’obtenir des animaux dépourvus de lymphocytes T et B et susceptibles de développer une colite similaire à celle observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La souris est également l’espèce la mieux adaptée aux conditions d’élevage de notre animalerie, ce qui permet d’assurer leur bien-être tout en réalisant des expériences scientifiquement pertinentes. Les expériences seront menées sur des souris sevrées, âgées d’au moins 4 semaines. Au-delà de 4 semaines le système digestif et le système immunitaire sont suffisamment matures pour les études prévues. L’âge auquel les animaux seront euthanasiés pour l’analyse des résultats dépendra du type d’expérience réalisée. Cette décision sera basée sur les données de la littérature scientifique et/ou sur les observations préliminaires obtenues lors des procédures expérimentales, afin de garantir la pertinence scientifique tout en minimisant la souffrance animale.
Impact des microplastiques alimentaires sur la réponse inflammatoire intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles boivent pendant 78 jours une eau chargée en microplastiques, et la moitié d'entre elles reçoit en plus un agent chimique qui déclenche une colite, quatre fois cinq jours à quinze jours d'intervalle, avec douleurs, saignements rectaux et perte de poids. Le dernier jour, 180 souris subissent une coloscopie sous anesthésie, puis toutes reçoivent une ponction de sang dans le cœur avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le porteur écrit que ce traitement est "sévère mais nécessaire" pour étudier les mécanismes de l'inflammation intestinale, et annonce qu'il baissera la dose au cycle suivant si elle s'avère trop forte.
Objectifs
Les microplastiques sont de minuscules particules, environ 70 fois plus fines qu’un cheveu, que l’on retrouve sous diverses formes (fragments, fibres, films, billes…) et compositions chimiques. Présents partout dans l’environnement, ils s’accumulent dans tous les écosystèmes, entraînant une ingestion involontaire par l’Homme évaluée à environ 52 000 particules par an. Notre projet vise à comprendre comment les microplastiques ingérés affectent le système immunitaire et l’inflammation intestinale. Nous évaluerons leur capacité à induire une inflammation intestinale, seuls ou en combinaison, dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre par quels mécanismes, les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin. Les résultats nous permettront aussi de déterminer si certains microplastiques sont plus néfastes que d’autres. De tels résultats sont indispensables pour comprendre comment la pollution environnementale influence notre santé digestive et pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques aux patients chroniques afin de freiner la progression de la maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Ce projet comporte 4 interventions : (1) L’administration des microplastiques via l’eau de boisson dans les biberons, pendant toute la durée du projet (78 jours) sur 320 animaux (tous sauf les contrôles), (2) le traitement pro-inflammatoire pour induire l’inflammation intestinale sera réalisé sur la moitié des animaux (200) avec un agent chimique administré dans l’eau de boisson 4 fois, à raison de 5 jours tous les 15 jours. (3) La coloscopie, examen de quelques minutes (10 maximum), sera réalisé sur 180 animaux le dernier jour du protocole sous anesthésie générale. (4) Un prélèvement de sang intracardiaque (3 minutes) sera réalisé sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’administration des microplastiques via l’eau de boisson ne devrait pas induire de nuisance pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Le traitement pro-inflammatoire (200 animaux) induit des inconforts, de la douleur, une perte de poids liée à une diminution de la prise alimentaire et/ou des saignements rectaux. Ce traitement est sévère mais nécessaire pour étudier les mécanismes de l’inflammation intestinale. Ce modèle est maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps et le protocole proposé a été validé dans un projet précédent. Nous savons repérer les symptômes rapidement afin de limiter la souffrance des animaux. La coloscopie (180 animaux) et le prélèvement sanguin intracardiaque (tous les animaux) seront réalisés sous anesthésie générale suivis immédiatement de la mise à mort par d’une dislocation cervicale. Il n’est pas attendu d’effets indésirables de ces interventions pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la dernière intervention afin de récupérer les différents organes.
Remplacement
La toxicité des microplastiques a été étudiée in vitro sur des modèles de cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Néanmoins, ces modèles in vitro ne permettent pas, actuellement de reproduire entièrement le processus d’inflammation intestinale. En effet, la complexité de la physiologie intestinale implique plusieurs systèmes cellulaires distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant tous les organes liés ou non au tube digestif dont les ganglions lymphatiques et la rate. Ainsi, aucun modèle in vitro ne peut actuellement se substituer aux modèles animaux pour étudier de manière fiable et intégrée les mécanismes sous-jacents à notre question de recherche.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre de souris par groupe, à savoir 40 souris par groupes réparties dans 10 groupes, soit un total de 400 souris, pour obtenir la puissance statistique suffisante pour toutes les analyses prévues, conformément aux exigences éthiques en expérimentation animale. Sur la base des données issues de la littérature scientifique et de nos données précédentes, les test statistiques réalisés ont donné un nombre d'animaux à 40 par groupe afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour réaliser à la fois les analyses in vivo (colite expérimentale, endoscopie rectale) et post mortem (profil immunitaire par cytométrie en flux, analyses transcriptomiques, microbiote intestinal, histologie, dosages biologiques) aux deux points finaux prévus dans le projet. Les expériences ont été conçues afin de réaliser un maximum d’analyses différentes compatibles sur les mêmes animaux afin d'en réduire le nombre tout en ayant suffisamment de matériel pour réaliser les différentes analyses. Cette approche intégrée vise à maximiser les données obtenues par individu et à limiter au strict minimum le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec à disposition des copeaux de bois, des cabanes en métal pour se cacher et grimper, et des buchettes de bois pour usure des dents. Pour éviter toute source extérieure de contamination en plastique, les enrichissement en carton et plastiques ne seront pas utilisés. Les coloscopies et prélèvements intracardiaques se feront sous anesthésie générale (isoflurane 4% à l’induction puis réduite à 2% en maintien), sans réveil. Une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place en amont. Pendant la colite, l’activité de la maladie sera scorée quotidiennement. De plus, les animaux seront surveillés deux fois par jour pour détecter des signes éventuels de mal-être (prostration/mouvements, yeux fermés/grimace, dos voûté, aspect du pelage, déshydratation). Le point limite est fixé selon ce score et les signes éventuels de mal-être (Annexe 3). A la fin de ce protocole, les animaux seront mis à mort et les organes prélevés permettront des analyses biologiques. Le modèle de colite expérimentale est un modèle maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement pro-inflammatoire est aussi très dépendante de l’environnement (microbiote intestinal). Si la dose s’avère trop sévère au premier cycle, elle sera réduite pour les cycles suivants. Grâce à notre expertise, nous sommes en mesure de repérer très rapidement les signes cliniques de la maladie afin d’intervenir sans délai et de limiter au maximum la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin. Le modèle d’inflammation par agent chimique est très largement utilisé en raison de sa simplicité d'administration (dans l'eau de boisson), de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée courte d’analyse du processus inflammatoire et de « récupération ». En matière d’étude préclinique, ce modèle reste le modèle de choix couramment décrit dans la littérature. Les souris utilisées auront 8 à 9 semaines. Le projet démarrera après deux semaines d’acclimatation. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte», ce qui correspond aux besoins du projet, les patients étant majoritairement de jeunes adultes.
Induction et suivi des modèles de colite chez le rat ou la souris pour évaluer le rôle des protéases et leurs récepteurs dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1800
L'état général des animaux est observé au minimum une fois par semaine, et tout individu atteignant un point limite est tué. 5 760 souris et rats vont être utilisés dans des modèles de colite, dont 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever le colon et l'iléon. La colite provoque perte de poids, diarrhée, sang dans les fèces et hypersensibilité viscérale. Les animaux subissent jusqu'à sept endoscopies sous anesthésie, un gavage pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant deux mois, et des administrations intracoliques pratiquées sur rat vigile en contention, avec un risque de perforation de l'intestin. L'objet est de tester des molécules candidates contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, et le porteur précise qu'aucun logiciel ni test statistique n'a servi à fixer l'effectif, son expérience des modèles lui suffisant.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation du tractus gastrointestinal. Il existe deux pathologies : la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces pathologies touchent entre cinq et six personnes sur 100 000. Elles débutent généralement chez le jeune adulte et touchent indifféremment les deux sexes. Les traitements disponibles aujourd’hui sont soit des traitements symptomatiques, soit reposant sur des actes chirurgicaux. Les causes des MICI sont encore mal connues. Les modèles animaux ont grandement enrichi notre compréhension de nombreuses pathologies intestinales. En plus d'améliorer la compréhension de la maladie, les modèles animaux sont également utilisés de manière importante pour tester les nouveaux médicaments ainsi que pour les interventions diagnostiques ou thérapeutiques précliniques. Des techniques d'imagerie sophistiquées ont été développées afin de surveiller l'activité de la maladie chez la souris. Ces techniques endoscopiques permettent une visualisation directe de l'inflammation intestinale ou la cicatrisation des plaies. Ce processus donne un état objectif en temps réel permettant des études chez le même animal à des moments répétés. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour les MICI chez le rat et la souris. Le modèle utilisé sera adapté aux cibles thérapeutiques à évaluer.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de l'inflammation dans les modèles de colite est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre projet vise a évaluer le rôle de récepteurs activés par les protéases et des protéases elles mêmes dans les modèles de colite.
Procédures
- endoscopie sur animal anesthésié (au minimum 2 fois maximum 7 fois) durée : 15 minutes par endoscopie - gavage minimum 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 2 fois par jour quotidiennement durée: 1 minute par geste - prélèvement de sang sur animal anesthésié 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 1 fois par semaine durée: 5 minutes par geste - administration intracolique de produit sur souris anesthésiée minimum 1 fois maximum 4 fois durée 2 minutes par geste - administration intracolique sur rat vigile en contention minimum 1 fois maximum 4 fois durée 3 minutes par geste - administration intrapéritonéale sur animal vigile 2 fois (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste -administration cutanée sur animal vigile (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste)
Impact sur les animaux
L'induction de la colite est caractérisée par la perte de poids des animaux, l'apparition de diarrhée et de sang dans les féces ainsi qu'une douleur et hypersensibilité viscérale. L'administration intracolique chez le rat vigile et le gavage peuvent induire du stress. L'endoscopie et les biospsies sont réalisées sous anesthésie mais il y a un risque de perforation de l'intestin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus (colon, ileon).
Remplacement
La colite est une réaction integrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’experimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'inflammation intestinale. Dans le cadre de ce projet, l’expérimentation animale est indispensable.
Réduction
La technique d'endoscopie utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux). De plus, les résultats obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: avant traitement versus après traitement). Les tests statistiques utilisés peuvent comparer les mesures sur le même individu ou entre individus. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Aucun logiciel ou test statistique n'ont été utilisé mais notre expérience de ces modèles nous permet de connaitre le nombre d'animaux minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. Les souris sont anesthésiées lors des administrations intracoliques et du prélèvement de sang.
Choix des espèces
Chaque espèce présente une sensibilité différente pour les différents modèles. Dans le but d’une plus grande homogénéité des réponses et donc pour limiter le nombre d’animaux nécessaire, nous utiliserons des espèces «sensibles » (plus reproductibles). Ainsi, en fonction du modèle : des rats (espèce pour laquelle le modèle est plus reproductible) et/ou des souris (le choix rat ou souris dépendra du mécanisme et/ou cible de la molécule à tester). De plus nous avons des souris transgéniques pour des protéases d'interet. 3 modèles seront réalisés car ils miment chacun des pathologies différentes. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. Leur métabolisme, leur système immunitaire et leur physiologie étant stabilisés nous auront ainsi moins de variation que sur des jeunes animaux.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Développement et évaluation de nouvelles sondes moléculaires marquées au deutérium pour l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Les souris utilisées sont soit porteuses d'une mutation qui déclenche une pathologie de type Alzheimer, soit greffées d'un glioblastome dans le cerveau, soit rendues stéatosiques par douze semaines de régime gras et sucré. Elles sont 175, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 95 d'entre elles et modéré pour 80. Chaque examen d'IRM dure de deux à trois heures sous anesthésie, précédé le cas échéant d'une mise à jeun de six heures, avec deux à cinq prélèvements de sang et l'injection de sucres marqués au deutérium, les souris du modèle Alzheimer passant jusqu'à quatre examens entre deux et huit mois d'âge. Toutes sont tuées en fin de procédure pour que leurs organes fournissent les données post-mortem censées valider les images acquises sur l'animal vivant.
Objectifs
En imagerie par résonance magnétique (IRM), le signal provient classiquement des noyaux d’hydrogène (1H) de l’eau présent dans tous les organes. Avec l’avènement en recherche de scanners IRM à très haut champ magnétique, la spectroscopie et l’imagerie RMN in vivo permettent de détecter et quantifier de nombreuses autres molécules ou ions d’intérêt pour la biochimie, la physiologie et la pharmacologie que ce soit en conditions normales ou pathologiques. Ceci ouvre la voie à de nouveaux outils d’exploration métabolique et fonctionnelle d’organes en conditions normales ou pathologiques. L’imagerie métabolique du deutérium (2H) repose sur le suivi de sucres marqués à cet isotope non-radioactif de l’hydrogène. Cette approche permet d’étudier de manière non-invasive le métabolisme des sucres dans des modèles animaux de pathologies et à terme chez des patients souffrant d’afflictions auxquelles sont associées des altérations métaboliques comme la maladie d’Alzheimer, les tumeurs ou encore la stéatose hépatique non-alcoolique. L’étude de ces altérations métaboliques servira à mieux comprendre ces maladies et possiblement à évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Par ailleurs, cette approche devrait être moins chère, plus versatile et plus accessible que d’autres modalités d’imagerie plus courantes. Dans ce contexte, notre projet vise au développement et la validation de sucres communément présents dans l’alimentation (tels que le glucose ou le fructose) marqués au deutérium pour l’étude des altérations métaboliques dans des modèles validés de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, le glioblastome et la stéatose hépatique non-alcoolique.
Bénéfices attendus
Les méthodes validées lors de ce projet seront utiles à court terme pour leur application à l’évaluation de traitement innovant chez ces modèles rongeurs de pathologies et à moyen terme pour préfigurer les études chez l’Homme par IRM du 2H. A plus long terme, l’imagerie métabolique du deutérium pourrait concurrencer d’autres modalités d’imagerie métabolique déjà utilisées en recherche clinique.
Procédures
Chaque examen IRM durera de 2 à 3 heures sous anesthésie. Des sucres marqués au deutérium seront administrés aux animaux anesthésiés avant ou pendant cet examen IRM pour suivre leur métabolisme : Etude d’un modèle transgénique d’Alzheimer : les souris seront imagées au plus 4 fois (à 2, 4, 6 et 8 mois). Etude d’un modèle de glioblastome : dans ce cas, il est nécessaire de réaliser une chirurgie d’implantation des cellules tumorales (durée approximative de 20 minutes) sur les souris. Celles-ci seront imagées une seule fois. Etude d’un modèle de stéatose hépatique non-alcoolique: les souris seront imagées une seule fois après 12 semaines d’un régime hyperlipidique et hyperglucidique. Dans tous les cas, 2 à 5 prélèvements sanguins de quelques secondes chacun pourront être réalisés, juste avant, pendant ou juste après l’examen IRM pour la détermination de certains paramètres physiologiques.
Impact sur les animaux
Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Des effets indésirables (stress, fatigue) peuvent exister en lien avec la contention, l’anesthésie pendant l’examen IRM et les éventuelles injections ou prélèvements de sang. Les injections de sucres marqués au deutérium sont réalisées juste avant ou au cours de l’examen IRM et peuvent entrainer une douleur transitoire. Dans le cas de l’administration de glucose marqué, l’animal est mis à jeun (typiquement 6 heures avant l’examen IRM) pour réduire sa glycémie basale et garder la glycémie stable pendant l’examen IRM. Concernant l’étude du modèle de tauopathie, les animaux sont utilisés à des âges d’au plus 8 mois, c’est-à-dire avant l’apparition de symptômes cliniques délétères induits par la maladie. Pour ce qui est de l’étude du modèle de glioblastome, la chirurgie nécessaire à l’implantation de cellules tumorales entraine une légère inflammation et une douleur transitoire. La croissance tumorale peut entrainer une perte de poids ou une apathie.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt. Ainsi, des données post-mortem biochimiques et d’imagerie haute-résolution seront acquises pour valider/compléter nos observations/résultats in vivo.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cultures 3D (organoïdes) sont prévus en amont de nos études in vivo afin d’évaluer la pertinence de cette approche alternative dans le cadre d’études d’imagerie moléculaire et métabolique par résonance magnétique nucléaire. Ce projet de recherche vise à valider in vivo la sensibilité et la spécificité de l’imagerie de molécules marquées au deutérium dans le contexte de trois pathologies chroniques complexes. Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative (modèle ex vivo ou computationnel) permettant de modéliser la complexité des mécanismes moléculaires, cellulaires, physiologiques ou de biodistribution inhérent à ce projet. Avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme, il est donc justifié de mener nos études chez le rongeur en raison de sa proximité évolutive avec l’être humain et du fait qu’il propose des modèles pathologiques versatiles et reproductibles.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal et si nécessaire de façon répétée avec des approches non-invasives comme l’IRM. S’agissant d’une recherche exploratoire, des effectifs de 20 ou 30 animaux par sous-groupe (condition et sexe) ont été considérés pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats. Le cas échéant, les effectifs seront réduits si les observations faites lors des expériences pilotes le permettent.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux stables conformément aux conditions stipulées en annexe III du décret 2013-118 du 1er février 2013 portant sur les exigences relatives aux soins et hébergement des animaux. Une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress avec notamment du matériel favorisant la nidification. Les animaux sont suivis régulièrement afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les points-limites et la structure chargée du bien-être animal et les conseils vétérinaires. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Un anesthésique local est appliqué au niveau des conduits auditifs. Un gel ophtalmique est passé sur les yeux pour limiter leur déshydratation. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Chirurgie : Pour l’implantation de cellules tumorales, les animaux recevront une antalgie préopératoire 30 minutes avant le début de la chirurgie, puis seront anesthésiés.
Choix des espèces
Les modèles souris représentent les modèles les plus utilisés en recherche biomédicale notamment parce que les études comparatives sont facilitées par l’existence de souches qui fournissent des animaux génétiquement similaires. Les modèles sélectionnés pour chaque procédure expérimentale correspondent à un état de l’art pour évaluer par IRM nos sucres deutérées. Les souris seront utilisées à partir d’un âge adulte typiquement de 6-8 semaines, et jusqu’à un âge de 8 mois uniquement pour l’étude d’un modèle transgénique d’Alzheimer.
Etude de biodistribution intestinale après administration de formulation d’ARNs par voie orale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Privées de nourriture pendant douze à quinze heures, puis gavées d'une formulation d'acides nucléiques, 68 souris saines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont anesthésiées par injection dans l'abdomen, saignées, puis tuées pour que leur intestin soit prélevé. L'enjeu déclaré est une étude de faisabilité, destinée à vérifier si ces formulations pénètrent les cellules intestinales avant d'envisager des expériences thérapeutiques sur un modèle murin de la maladie. Le porteur annonce des mises à mort "à différents temps post-gavage" sans préciser lesquels, et fonde son effectif sur des lots de quatre animaux sans détailler comment il arrive à soixante-huit.
Objectifs
Cette demande d'autorisation de projet concerne une expérience préliminaire de mise au point et de faisabilité chez la souris. Dans le cas de pathologie intestinale, une possibilité de traitement est l'administration d'acides nucléiques par voie orale pour provoquer l'expression d'un gène dans les cellules intestinales. Notre laboratoire met au point des formulations d'acides nucléiques à cet effet. Nous voulons ici étudier sur animaux sains la biodistribution de ces formulations dans le tissu intestinal. Pour cela, les formulations seront administrées aux animaux par gavage. A différents temps post-gavage, les animaux seront mis à mort et les tissus intestinaux prélevés pour analyse histologique ou cytométrique ultérieure. Ceci nous permettra d'évaluer dans quels types cellulaires intestinaux se trouvent les acides nucléiques administrés, dans quelles proportions et pendant combien de temps, et de déterminer si le projet peut être poursuivi par des expériences thérapeutiques chez la souris avec un modèle animal transgénique de la pathologie.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet permettra de savoir si nos formulations d'acides nucléiques pénètrent efficacement dans les cellules intestinales, permettant une expression ou inhibition de gène, et pendant combien de temps. En cas de succès, cela nous permettra de poursuivre un projet à plus long terme de thérapie génique contre une maladie génétique intestinale héréditaire.
Procédures
Les animaux subiront une privation de nourriture (mais pas d'eau) pendant 12 à 15h. Ils subiront ensuite l'acte de gavage, qui dure de 15 à 30 secondes. Au temps nécessaire, les souris seront anesthésiés par injection intrapéritonéale, ce qui dure environ 15 secondes, puis du sang sera prélevé sous anesthésie, l'acte durant quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un gavage : la contention et le gavage seront source d'un stress léger à modéré de courte durée, de même que la privation de nourriture pendant 12 à 15h. L'anesthésie par injection intrapéritonéale causera un stress et une douleur légère de courte durée.
Devenir
Comme les analyses nécessaires seront réalisées sur les tissus intestinaux, que nous devrons prélever, tous les animaux seront mis à mort
Remplacement
Nous avons effectué toutes les analyses physicochimiques nécessaires à propos de nos formulations d'acides nucléiques, et vérifié leur efficacité sur culture cellulaire. Nous avons également montré que ces formulations transfectent des lignées cellulaires de type intestinal. Mais nous devons nous assurer de l'efficacité réelle sur un intestin complet, pour lequel aucun modèle ex vivo n'existe. Nous devons donc avoir recours à l'expérimentation animale.
Réduction
Ce projet n'est pas une évaluation thérapeutique, mais une étude de faisabilité et par expérience d'un projet précédent portant sur la colite ulcérative, et d'autres études de biodistribution du laboratoire, nous savons que 4 animaux par lots suffisent à obtenir une évaluation qualitative exploitable après analyse par un test statistique non paramétrique. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé sur la base de 4 animaux par lots. Nos études précédentes nous permettent par ailleurs de n'étudier qu'une seule dose de siRNA, que nous savons être efficace. Pour les ARNm messagers, pour lesquels nous avons moins de recul, deux doses seront étudiées, en se basant sur la littérature.
Raffinement
Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour supprimer la douleur. Des points limites spécifiques ont été mis en place pour éviter toute douleur aux animaux. Les animaux seront hébergés par groupes dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Nous devons réaliser nos études sur un intestin de mammifère. Celui de la souris est suffisamment proche de l'intestin humain pour permettre d'obtenir des résultats pertinents. De plus, un modèle murin de la pathologie existe, avec lequel nous pourrons poursuivre le projet. Nous utiliserons des souris jeunes adultes au système intestinal complet et fonctionnel.
Etudes fondamentales et appliquées des interactions entre bactériophages et bactéries chez l’animal.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
Infectées par des bactéries pathogènes dans les poumons, l'intestin ou la vessie, puis soumises à des gavages et à des instillations intranasales et intratrachéales jusqu'à deux fois par jour, 16 984 souris vont être utilisées, 12 712 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 4 272 un niveau léger. Certaines subissent des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaine pendant soixante jours. Le porteur décrit des atteintes brèves, difficultés respiratoires pendant 24 heures au plus, diarrhée pendant 48 heures, "gêne limitée" pour les infections urinaires, tout en prévoyant la mise à mort de toute souris prostrée, ayant perdu plus de 20 % de son poids ou diarrhéique au-delà de deux jours. Aucune ne sort vivante du projet, le porteur indiquant qu'elles sont devenues porteuses potentielles de la bactérie et que la plupart doivent être tuées pour l'analyse de leurs organes vitaux.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries et qui peuvent être utilisés pour traiter des patients infectés par des bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, les bactériophages font partie de la flore microbienne naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, ce projet nous permettra d’étudier les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans trois organes cibles : les poumons, les intestins et la vessie. Les connaissances qui seront acquises permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont directement liés à l’utilisation thérapeutiques des bactériophages. Aujourd’hui le nombre de personnes en situation d’impasse thérapeutique et qui ont accès à titre compassionnel à la phagothérapie augmente faiblement car nous manquons de données expérimentales pour soutenir les meilleures conditions d’utilisation. Ce projet permettra à terme de fournir les éléments de compréhension sur les mécanismes impliqués dans l’efficacité de la phagothérapie. Nous apporterons aussi des informations relatives à la dose, la fréquence et la voie d’administration les plus appropriées. De même, nous appréhenderons le rôle du système immunitaire dans l’efficacité des traitements. A terme, le déploiement à plus grande échelle de la phagothérapie repose sur les données que nous pourrons obtenir au cours de ce projet.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes) au maximum d’une fois par semaine sur 25 jours, ou des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaines pendant 60 jours au maximum avec parfois un suivi plus fréquent jusqu’à deux fois par jour pendant 5 jours (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes pour collecter les feces). Les administrations par gavage (quelques secondes) ainsi que les instillations intranasales et intratrachéales seront limitées à 2 par jour.
Impact sur les animaux
Les animaux qui seront infectés par des bactéries pathogènes subiront un stress en relation avec l’organe étudié. Lors d’infections pulmonaires les animaux présenteront des difficultés respiratoires pendant une durée maximale de 24h. Lors d’une infection intestinale, des signes de diarrhée peuvent persister pendant 48h au maximum. Ces situations peuvent provoquer un défaut d’alimentation induisant une baisse de la mobilité. Les infections urinaires seront quant à elles d’une courte durée (24h au plus) et induiront une gêne limitée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptibles de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.
Remplacement
L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbiennes d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.
Réduction
L’ensemble de ces études s’appuient sur des données préliminaires obtenus in vitro et dont les résultats permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque seuls les éléments les plus pertinents, au regard de la question scientifique posée, sont évalués chez l’animal. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’imagerie sera utilisée pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Les animaux infectés seront évalués 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 attribué aux animaux présentant une perte de poids supérieure à 10% et ayant une mobilité réduite, déclenchera l’ajout d’un gel hydrique pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avec le SBEA avant d’être mise en place.
Choix des espèces
A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Enfin les données et les outils disponibles sur le système immunitaire murin sont aussi une raison justifiant le recours à ces animaux. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.