Système gastrointestinal

Un lupus provoqué par une injection unique dans le péritoine, une arthrite par deux injections intradermiques, une colite chimique : 540 souris sont soumises à ces modèles inflammatoires puis à des séances d'imagerie de trente minutes, cathéter posé sous anesthésie profonde, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue. Le porteur veut valider un agent de contraste couplé à un anticorps pour visualiser sans biopsie les agrégats immunitaires qui se forment dans les tissus enflammés. Il décrit pourtant, pour la colite, une diarrhée, des saignements et une souffrance de durée possiblement prolongée sur plusieurs jours, et fixe la mise à mort à plus de 20 % de perte de poids ou à un score de grimace supérieur à 1,5.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats immunitaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse immunitaire locale. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures entretiennent la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules vasculaires très spécialisées, qui expriment un motif appelé PNAd. Ce motif est reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie. Un nouvel agent de contraste biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.

Bénéfices attendus

La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse microscopique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des TLS. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront suivis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des des saignements. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition de douleurs articulaires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'un saignement pulmonaire. Néanmoins, les souris utilisées ici, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite est susceptible de produire des douleurs et gonflements articulaires. La réalisation de l'imagerie, accompagnée de la pose d'un cathéter veineux peut se traduire par une douleur au point d'injection, une inflammation, une infection du site, une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel ou igloo, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une déshydratation seront réhydratés. Les animaux présentant des signes de douleur ou d'inconfort (mouse grimace scale > 0.5, isolement, horripilation, respiration rapide) recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale, une anesthésie locale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de vieillissement fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles.

Pour savoir si une protéine étudiée par l'équipe participe à la fibrose de la cholangite sclérosante primitive, une maladie des voies biliaires, des souris d'une lignée qui développe spontanément une maladie du foie, génétiquement modifiées pour ne pas exprimer cette protéine dans le foie, sont étudiées à partir de 4 semaines selon le stade de la maladie. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte de leurs tissus. La seule procédure décrite est une prise de sang terminale d'environ une minute sous anesthésie, mais la lignée développe une jaunisse liée à la rétention de bile, une fibrose des voies biliaires et une hypertension portale, avec une perte de poids et un stress à l'effort possibles entre 8 et 12 semaines. Les points limites, dits précoces, ne sont pas détaillés. Le porteur décrit les souris comme "de petits mammifères très proches de l'homme" et sa lignée comme "le modèle le plus pertinent en termes d'homogénéité et de reproductibilité" dont il dispose.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la cholangite sclérosante primitive (CSP). La CSP est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La CSP est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés, il n’existe actuellement aucun traitement pour cette maladie. Nous étudions une protéine d’intérêt localisée sur la membrane cellulaire, jouant un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette cible thérapeutique qui ralentit la croissance tumorale des cancers du foie et le processus de fibrose hépatique. Ainsi l’objectif de ce projet est d’évalué le rôle essentiel que joue notre cible thérapeutique dans le développement de la fibrose dans le cas d’une CSP. Pour cela, un nouveau modèle de souris a récemment été développé afin d’obtenir une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’évaluer l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt sur le développement de la CSP.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à évaluer l’implication d’une cible thérapeutique sur le développement de la CSP. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre et d’affirmer le rôle de cette cible dans le développement de la CSP. L'objectif de l'ensemble du projet est de comprendre comment notre cible thérapeutique participe à l’évolution de la maladie et d’identifier des voies cellulaires dérégulées, et potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris développe spontanément une maladie hépatique caractérisée par une cholestase intrahépatique avec ictère, une fibrose biliaire, une hypertension portale. Une perte de poids et un stress à l’effort entre 8 semaines et 12 semaines peuvent être observé.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques seront appliquées lors des gestes le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une CSP. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge de 4 semaines minimum. Ce choix permettra une étude en fonction du stade de la maladie.

Pour vérifier si un déséquilibre du microbiote intestinal accélère l'apparition de tumeurs cutanées, 32 souris porteuses d'une neurofibromatose de type 1 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la peau de leur dos. Elles boivent des antibiotiques pendant huit semaines au maximum et passent deux fois sous anesthésie pour un rasage, une épilation et des photographies du dos. Certaines sont isolées, un stress social que le porteur dit compenser par des abris et des matériaux de nidification. Il présente ce protocole comme un modèle "plus éthique" et moins invasif que les lésions cutanées jusqu'ici pratiquées, alors que l'objectif déclaré est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique qui touche environ un million de personnes dans le monde. Les signes de cette maladie peuvent varier considérablement d’un individu à l’autre, même au sein d’une même famille. L’une de ses caractéristiques les plus visibles est l’apparition de petites tumeurs bénignes sur la peau, appelées neurofibromes cutanés (NFc), dont le nombre et la sévérité sont très hétérogènes. En plus de l’impact esthétique, ces tumeurs peuvent provoquer des démangeaisons, des douleurs et altérer fortement la qualité de vie. Cette grande variabilité suggère que, outre les causes génétiques, d’autres facteurs, notamment environnementaux, pourraient influencer l’apparition et la gravité des symptômes. Le microbiote intestinal désigne l’ensemble des micro-organismes (bactéries, virus, champignons, etc.) qui colonisent le tube digestif. Il joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions physiologiques, telles que la digestion, l’immunité et l’équilibre métabolique. Un déséquilibre de cette communauté microbienne, appelé dysbiose, est fréquemment associé à des pathologies inflammatoires ou tumorales. Des résultats préliminaires obtenus à partir d’un modèle murin reproduisant la NF1 humaine montrent que l’administration d’antibiotiques, connue pour induire une dysbiose, est associée à un développement des NFc. Le lien de causalité entre cette altération du microbiote et les effets observés reste toutefois à établir. Le projet proposé vise précisément à mieux comprendre ce lien et à identifier les mécanismes sous-jacents.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider et approfondir une observation préliminaire concernant l’effet d’un traitement antibiotique sur l’apparition et la progression des NFc. Il a pour objectif de mieux comprendre les liens entre le microbiote intestinal, l’inflammation et la tumorigenèse dans la NF1, ainsi que d’évaluer si ces effets peuvent être modulés par des interventions complémentaires. Les bénéfices attendus incluent des avancées scientifiques significatives sur le rôle des facteurs environnementaux dans la pathogénie de la NF1. Par ailleurs, grâce à un plan expérimental repensé, ce projet vise également à valider un nouveau modèle d’étude de la NF1 plus éthique, en proposant des protocoles moins invasifs ou stressants pour les animaux et cliniquement pertinent, reflétant davantage la diversité des patients.

Procédures

Les antibiotiques à tester seront administrés aux souris dans leur eau de boisson, pendant une période maximale de 8 semaines. Cette méthode est simple et ne cause aucune douleur ni gêne aux animaux, car elle ne nécessite pas d’anesthésie ni de manipulation particulière. Pour observer l’évolution des NFc, des photographies du dos des souris seront prises après un rasage et une épilation localisés. Ces interventions se dérouleront sous anesthésie générale (moins de 5 minutes par animal), afin d’éviter tout stress ou douleur. Deux séances seront réalisées, espacées de plusieurs semaines, dans des conditions standardisées garantissant la reproductibilité des observations et le respect du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Les NFc qui apparaissent dans ce modèle murin sont petits, plats et non douloureux. Des études récentes montrent que, chez les personnes atteintes de NF1, ces tumeurs sont souvent moins sensibles aux sensations de chaleur ou de pression que les zones de peau normales. Dans les observations précédentes, les animaux porteurs de la mutation ne présentent aucun signe de souffrance ni de détérioration de l’état de santé avant l’âge d’un an. Le traitement antibiotique utilisé dans cette étude peut toutefois entraîner des effets secondaires, comme des troubles digestifs ou des modifications du comportement. C’est pourquoi les animaux seront surveillés de près tout au long de l’expérience, afin d’identifier rapidement tout signe de gêne ou d’inconfort. Certaines manipulations, telles que le maintien doux pendant quelques minutes ou l’anesthésie courte pour les prises d’image, peuvent entraîner un stress modéré, maîtrisé grâce à un entraînement préalable à la manipulation. L’épilation occasionnelle peut provoquer une irritation cutanée temporaire, systématiquement contrôlée. Dans les cas où des souris doivent être isolées, des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter l’impact du stress social, notamment par l’enrichissement du milieu (abris, matériaux de nidification). L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les effets indésirables potentiels, dans le respect strict des standards de bien-être animal.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement la formation des NFc observés chez les patients atteints de NF1. Le modèle murin utilisé ici reste actuellement le seul outil disponible pour l’étude de cette forme tumorale et pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Réduction

L’inclusion des femelles dans cette étude, et probablement dans les futures — rendue possible par l’induction des symptômes via l’antibiothérapie — permet d’optimiser l’utilisation des portées issues des croisements, tout en réduisant la nécessité de générer de nouveaux animaux. Le nombre total de souris par groupe a été défini à partir de la fréquence attendue des lésions, de leur sévérité et du nombre d’observations nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes. Les protocoles, le suivi et les méthodes d’analyse ont été standardisés à partir d’expériences antérieures, permettant une réduction notable du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort. L’administration des antibiotiques se fait par l’eau de boisson, sans manipulation directe. Les anesthésies nécessaires (épilations et photographies) sont brèves, réalisées avec précautions (utilisation d’un tapis chauffant et d’un gel ophtalmique). Des soins post-interventionnels comme l’application de vaseline limitent les irritations cutanées. L’isolement temporaire de certains animaux sera compensé par un enrichissement environnemental renforcé. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel technique, y compris les week-ends, avec l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être incluant des points limites. En cas de signe de détresse persistant plus de 24 h, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort selon les standards réglementaires. Enfin, ce projet permet de valider un modèle reposant sur la dysbiose intestinale comme facteur déclenchant, sans recours aux lésions cutanées jusqu’ici nécessaires. Cette avancée ouvre la voie à des pratiques plus respectueuses du bien-être animal dans les futures études sur la NF1.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est une lignée murine génétiquement modifiée reproduisant fidèlement les manifestations cutanées de la NF1, notamment l’apparition progressive des NFc. Ce modèle constitue à ce jour l’outil le plus adapté pour l’étude des mécanismes pathologiques de la NF1 et pour le criblage préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés seront des souris mâles et femelles âgées de 45 jours au début du protocole. Ce stade de développement correspond à la période initiale de formation des NFc dans ce modèle, garantissant la pertinence des observations et l’efficacité du suivi longitudinal.

Une chirurgie de 90 minutes interrompt puis rétablit la circulation sanguine dans le foie de 836 souris, qui subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une ou deux injections des molécules testées, puis deux prélèvements sanguins pour 616 d'entre elles et six pour les 220 autres. L'opération peut occasionner des douleurs pendant environ 72 heures, ainsi qu'une fatigue et une baisse de mobilité. Les organes sont prélevés sur des animaux tués, ce que le porteur justifie par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'architecture et la vascularisation du foie, d'où il conclut qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal.

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une greffe. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Des recherches récentes ont montré qu’un traitement agissant sur le métabolisme des cellules permettait de réduire ces lésions, du moins dans le cas du rein. Le but de notre projet est de tester cette approche sur un autre organe : le foie. Pour cela, nous allons tester trois molécules différentes sur un modèle de souris pour voir si elles peuvent protéger le foie contre les effets de l’ischémie-reperfusion.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu dans la protection des lésions l’ischémie-reperfusion hépatiques, afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le rein, le coeur, le pancréas, les poumons. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Tous les actes décrits concernent toutes les souris. 1 ou 2 injections des molécules testées (durée de l'intervention 1 minute). En fonction du site d'injection, elles seront faites sur animal vigile ou anesthésié. S'il y a 2 injections, elles seront espacées au moins de 90 minutes. 1 acte chirurgical sous anesthésie d'une durée de 90 minutes pour provoquer l'ischémie-reperfusion du foie. 2 prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie (616 animaux), et 6 prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie (220 animaux), pour mesurer différents paramètres biologiques. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'un minimum de 20 heures.

Impact sur les animaux

Les injections sur animal vigile pourront induire un stress transitoire de moins d'1 minute ainsi qu'une légère douleur de moins de 5 minutes. La douleur liée aux injections et aux prélèvements de sang sur animal anesthésié sera minorée par l'utilisation d'antalgique local. Suite à l'anesthésie de 90 minutes, l'effet attendu au réveil est un stress léger et un inconfort léger, tous deux d'une durée de 15 minutes. En post-opératoire, la chirurgie peut occasionner des douleurs pendant environ 72 heures, qui sont minorées par l'administration d'antalgiques. Une légère perte de poids peut aussi être observée qui sera reversée en 72 heures. Après ischémie-reperfusion hépatique, une fatigue et une diminution de la mobilité sont attendues ; elles disparaissent sous 72 heures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro du foie, cependant ces modèles sont très limités pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Les groupes contrôles serviront à plusieurs conditions expérimentales. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Certaines injections et les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. La procédure chirurgicale sera réalisée en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être et diminuer leur stress.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2). La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude.

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant six à douze mois à des régimes enrichis en gras et en sucre destinés à provoquer une stéatose puis un cancer du foie, avec une injection intraveineuse sous anesthésie, huit à douze échographies hépatiques, trois prélèvements de sang et un transport entre deux établissements. Le porteur attend une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité et leur comportement, ainsi qu'une altération de l'état général liée au développement des tumeurs. Les retombées annoncées, de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles pistes thérapeutiques, sont renvoyées à un "futur proche", tandis que le recours à la souris est déclaré "indispensable" au motif qu'aucune lignée cellulaire ne restituerait les interactions du foie avec les autres organes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnostic et pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée). Enfin, le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.

Bénéfices attendus

Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.

Procédures

Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.

Devenir

A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.

Remplacement

Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.

Réduction

Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.