Système urogénital

84 000 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un projet dont l'objet unique est le génotypage des lignées transgéniques élevées par le laboratoire. À trois à six jours de vie, chaque souriceau est immobilisé moins de trois minutes et l'extrémité de sa queue est coupée, un second prélèvement pouvant être fait à l'oreille avec une pince emporte-pièce. Le porteur reconnaît un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme, et indique qu'une méthode de génotypage sur le poil est à l'essai. Les souris ne portant pas le génotype recherché servent pour partie à l'apprentissage de la contention avant d'être tuées, les autres partent vers les projets de recherche du laboratoire ou vers le renouvellement des accouplements.

Objectifs

Les projets de recherche du laboratoire impliquent l'utilisation de plusieurs lignées de souris transgéniques qui nécessitent un élevage pour augmenter les effectifs de souris dont le génotype est adapté aux protocoles mis en place. Nous hébergeons et produisons environ 30 lignées différentes de souris génétiquement modifiées avec la nécessité parfois de créer de nouveaux modèles comme par exemple, des croisements de deux lignées génétiquement modifiées existantes. Le génotypage est une étape indispensable au bon déroulé des projets du laboratoire et doivent être réalisés précocément pour la mise en place ultérieure des protocoles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Les recherches menées à l'unité grâce à l’utilisation d’animaux transgéniques ont des objectifs multiples : - accroitre les connaissances sur les mécanismes conduisant aux maladies rénales - développer des traitements, des outils et des approches plus efficaces contre l'insuffisance rénale - étudier la génétique des maladies rénales rares héréditaires et acquises - comprendre les mécanismes de formation des calculs rénaux. Ces thématiques sont d'une importance cruciale en matière de santé publique. Par ailleurs, la méthode utilisée pour la caractérisation du génome permet de sélectionner les animaux d’intérêts et ainsi constituer des groupes expérimentaux stables de manière précoce.

Procédures

Une contention de moins de 3 minutes pour la biopsie. Prélèvement d'une petite partie distale de la queue . Et si besoin d'un deuxième prélèvement il sera éffectué au niveau de l'oreille avec une pince emporte pièce adapté à la souris .

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible . Eventuel infection possible au niveau du prélèvement mais reste très rare .

Devenir

Les animaux ne portant pas le génotype d'intérêt seront pour une première partie utilisés pour de l'apprentissage à la contention et l'autre partie sera euthanasiée par une méthode réglementaire . Les autres animaux portant le bon génotype seront utilisés dans les projets de recherche ou pour des renouvellement d'accouplements, l'élevage étant en continue .

Remplacement

En raison notemment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l'état encore embryonnaire de la recherche sur les organoides, l'étude des maladies rénales requiert l'obtention de tissu rénal prélevé sur l'animal. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l'évolution de la défaillance chronique progressive d'organes. Les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles pour étudier des mutations, des invalidations ou des surexpressions de gènes d'intérêt. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain , en particulier pour les étapes du développement embryonnaire.

Réduction

Le génotypage précoce des souriceaux permet de conserver uniquement les animaux avec le génotypage d’intérêt et de constituer des lots expérimentaux avant le sevrage des animaux, pour l’utilisation future dans des projets autorisés de l’unité . Dans le cadre de l'apprentissage à la contention nous utilisons une partie des animaux qui ne sont pas utilisés dans les projets de recherche. Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé sur la base des productions des années antérieures. Le projet requiert l’utilisation de 84000 animaux sur une période de 5 ans en utlisant trente lignées différentes pour l'élevage.

Raffinement

Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés ,dans les zones d’hébergement un contrôle de la température et de l’hygrométrie est effectué tous les jours , un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau . Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un transfert d’odeurs est réalisé sur les gants de l’opérateur pour minimiser le risque de rejets des nouveaux- nés par la mère ou de cannibalisme . Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.Une mise au point d'une autre méthode moins invasive est en cours d'essais pour du génotypage sur le poil .

Choix des espèces

Les équipes de recherche de l'unité travaillent sur des modèles souris génétiquement modifiées. Par conséquent, la plateforme animalerie est chargée de la production de ces souris et de la collecte des échantillons d’ADN (biopsie de queue) de manière précoce dans le but de caractériser le génome. Pour les besoins des activités de recherche, une identification et un génotypage précoces sont requis. Les deux interventions sont réalisées à l’âge de 3 à 6 jours post natal.

Confirmer in vivo des observations déjà obtenues in vitro, parce que les rapporteurs des revues le réclament systématiquement à la publication : 1 050 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit deux injections intrapéritonéales d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle, puis est mise à mort au plus tard vingt-quatre heures après la seconde pour disséquer les ovaires et les oviductes et récolter les ovocytes. Le porteur compte environ vingt-cinq ovocytes par femelle et une souris par lot d'expérience, soit 210 souris par an sur cinq ans. Il indique privilégier la maturation in vitro, qui donne davantage d'ovocytes, et recourir par ailleurs à la levure et au xénope pour certaines questions.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes qui régulent la méiose dans l’ovocyte de souris. La méiose consiste en deux divisions successives conduisant à la formation des gamètes. En particulier, dans l’ovaire, les ovocytes sont immatures et sont arrêtés en début de méiose. Une stimulation hormonale induit la maturation méiotique et l’ovulation. Les ovocytes matures sont arrêtés en fin de méiose et sont ovulés dans l’oviducte où ils pourront potentiellement être fécondés par un spermatozoïde. Le plus souvent, au laboratoire, nous prélevons des ovocytes immatures dans l’ovaire et nous induisons la maturation méiotique des ovocytes in vitro afin d’obtenir des ovocytes matures. Cette stratégie nous permet de suivre les différentes étapes de la méiose mais a l’inconvénient de s’éloigner des conditions physiologiques in vivo. C’est pour cela, que nous avons besoin de confirmer certaines de nos observations dans des ovocytes matures in vivo, prélevés dans l’oviducte après ovulation. Cette stratégie nécessite de faire une hyperstimulation ovarienne des souris afin de stimuler la maturation des ovocytes et l’ovulation. La procédure décrite dans ce projet inclut : 1) l'hyperstimulation ovarienne par injection d'hormones sur des souris femelles 2) la mise à mort des souris injectées pour dissection des oviductes et collecte des ovocytes. Nous utilisons des souris non modifiées ou des souris génétiquement modifiées. Aucune des souris que nous utilisons ne présentent de phénotype dommageable. Dans tous les cas, les souris ne seront injectées que dans le but de stimuler la maturation des ovocytes et l'ovulation. Aucune manipulation autre que les injections d’hormones et mise à mort ne sera réalisée sur les souris.

Bénéfices attendus

Même si la maturation in vitro des ovocytes présente des avantages indéniables tels qu’une facilité de synchronisation, et l’accessibilité à toutes les étapes de la méiose, on ne peut pas exclure un effet de la culture in vitro sur différents aspects de la méiose que nous étudions. Les ovocytes matures in vivo après stimulation ovarienne sont de meilleure qualité et dans un état plus physiologique que les ovocytes qui ont maturé in vitro. Ainsi, la stimulation ovarienne nous permettrait de confirmer dans des ovocytes matures in vivo, les observations obtenues après maturation in vitro, afin d’exclure tout effet de la culture in vitro sur nos interprétations. Cette confirmation devient essentielle et est systématiquement réclamée par les rapporteurs lors de la publication de nos données.

Procédures

Les souris seront soumises à 2 injections intrapéritonéales à 48h d’intervalle. Elle seront systématiquement mises à mort maximum 24h après la 2e injection pour la dissection des ovaires et des oviductes. Aucun accouplement, et aucune gestation n'est prévu après les injections.

Impact sur les animaux

L’injection intrapéritonéale d’hormones est une procédure légère. les effets indésirables sont: -le stress dû à la contention -la douleur induite par l’introduction de la seringue. En cas de signes de douleurs persistants comme la prostration de l'animal, l’animal sera immédiatement mis à mort. A noter qu'aucun accouplement ni gestation ne sera réalisé après la procédure de stimulation ovarienne, le but n'étant pas ici d'augmenter la taille de la portée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issu de la procédure car après stimulation ovarienne, les oviductes seront prélevés afin de collecter les ovocytes matures qui ont été ovulés.

Remplacement

La méiose est spécifique des cellules germinales et peut être observée uniquement dans les gamètes (ovocytes ou spermatozoïdes). Pour étudier la méiose femelle, nous sommes donc obligés d’utiliser des ovocytes issus d’animaux car il n’existe pas de lignées cellulaires méiotiques. Nous utilisons la levure comme modèle alternatif non animal, et le xénope comme modèle non mammifère, pour adresser certaines questions spécifiques. Notamment les approches protéomiques qui nécessitent une quantité importante de protéines sont réalisées dans la levure. Cependant la maturation méiotique dans la levure est différente de celle des mammifères et certaines questions ne peuvent pas être étudiées dans la levure ou dans le xénope. Ainsi, certains de nos résultats nécessitent d’être confirmées dans un modèle animal plus proche de l’homme comme la souris.

Réduction

Afin de réduire le recours aux injections et de minimiser la souffrance des animaux, nous privilégions la maturation d’ovocytes in vitro, qui nous permet aussi d’obtenir une quantité plus importante d’ovocytes et de limiter le nombre de souris utilisées. Cette procédure de stimulation ovarienne ne sera utilisée que ponctuellement pour confirmer certaines observations et dépend donc des résultats obtenus préalablement in vitro. Le nombre de souris femelles nécessaire dépend du nombre d’ovocytes collectés/femelle. Le nombre moyen d'ovocytes/femelle collectés dans l'oviducte après stimulation ovarienne est de 25 ovocytes/femelle. Pour qu'une expérience soit interprétable, nous avons besoin d’environ 10-20 ovocytes/lot donc 1 souris/lot. Un lot correspond par exemple à un lot d'ovocytes contrôles, un lot d'ovocytes exprimant une mutation, ou un lot d'ovocytes traités avec un inhibiteur. Nos expériences incluent 2 à 4 lots donc 2 à 4 souris. Chaque expérience devant être répétée 4 fois, nous devront utiliser 8 à 16 souris par expérience. Le nombre d’expérience nécessitant cette procédure est variable et difficile à estimer. En se basant sur les expériences prévues pour l’année à venir, nous estimons avoir besoin de 192 souris (une douzaine d’expériences). 64 souris swiss, 64 souris C57Bl/6, 64 souris transgéniques. Après majoration de 10% pour palier aux éventuels échecs de la stimulation ovarienne, nous estimons avoir besoin de 210 souris/an. Pour réduire le nombre de souris, nous optimisons au maximum l’utilisation des ovocytes, en réalisant plusieurs expériences sur le même lot d’ovocytes (par exemple, une fixation sur ovocyte entier et un étalement chromosomique, ou plusieurs marquages protéiques). Les tests préalables aux expériences : efficacité des inhibiteurs, test de concentration des inhibiteurs, test d’anticorps, sont évidemment réalisés sur des ovocytes matures in vitro.

Raffinement

Seules les injections d’hormones peuvent affecter le bien-être des animaux et induire du stress lors de la contention. Cette procédure sera réalisée par un manipulateur expérimenté pour limiter ce stress et les souris injectées seront soumises à une surveillance accrue afin de détecter le moindre signe de douleur après l’injection comme la prostration. En cas de signe de douleur, l’animal sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère qui est à la fois très proche de l’Homme et dont les gamètes sont facilement accessibles pour étudier la méiose. La maturation méiotique dans l’ovocyte est très similaire à celle de l’ovocyte humain, permettant d’extrapoler nos interprétations à l’Homme. Les souris femelles sont utilisées à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines car c’est à cet âge qu’elles produisent le plus grand nombre d’ovocytes.

Expédiées à deux ou trois mois vers un autre établissement pour y servir dans un projet distinct, les souris kF-DH sont élevées pour reproduire une maladie rénale liée au dépôt d'anticorps produits par une cellule cancéreuse. 640 souris porteuses de ce phénotype dommageable vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le génotypage se fait par poinçonnage du pavillon de l'oreille après dix-sept jours, une bague d'identification étant posée sur l'autre oreille. Celles qui restent pour la reproduction sont tuées avant six mois, soit avant que l'insuffisance rénale ne se déclare, et le porteur indique qu'à la fin du projet l'élevage sera arrêté et la lignée conservée sous forme cryoarchivée.

Objectifs

Dans certaines maladies rénales, un anticorps fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré- cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie rénale observée chez l’homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les mécanismes de développement des lésions rénales en aval des dépôts d’immunoglobulines, afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique plus large, déposé, pour lequel nous espérons plusieurs bénéfices : - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec cette maladie). Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 17 jours. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement les animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.

Impact sur les animaux

Les souris doubles mutées présentent à partir de 8 mois une perte progressive de fonction rénale. Les symptômes de l'insuffisance rénale terminale sont, chez l'homme et la souris, très peu spécifiques. Les principaux symptômes, ou nuisances, seront donc une asthénie, un amaigrissement et une altération de l'état général et du comportement traduite par un poil hérissé, une baisse de la réactivité, ou une prostration. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).

Devenir

Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt kF-DH sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable avec leurs contrôles DH (sans phénotype dommageable) et utilisée dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des animaux kF-DH sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie des dépôts d’immunoglobulines monoclonales. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 640 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux kF-DH mutés de manière homozygote pour les deux modifications génétiques et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 8 mois seront suivis tous les jours à partir de deux mois et ce jusqu'à leur envoi à 2-3 mois vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour les croisements et mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime. Les animaux seront suivis avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les seules espèces permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les souris doubles homozygotes kF-DH seront utilisées pour les croisement dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à 6 mois, soit avant le développement du phénotype dommageable. Dans l'article initial, les souris commencent à développer des lésions rénales à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans retentissement rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Les animaux doubles homozygotes kF-DH envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 2-3 mois.

13 000 souris vont être utilisées pour un unique geste de quelques secondes chacune, une biopsie de la queue pratiquée sur animal vigile dès l'âge de dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert à trier les descendants de croisements destinés à invalider seize gènes de la reproduction. Le porteur reconnaît que la contention et le geste provoquent une douleur légère et un stress. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées et leurs tissus récupérés, les autres restent en vie pour intégrer d'autres projets de recherche que le RNT ne décrit pas.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales dans le domaine de la biologie de la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à comprendre les mécanismes qui gouvernent la gamétogenèse, le processus biologique qui permet la formation des gamètes, les cellules sexuelles impliquées dans la reproduction. Pour cela seize gènes clefs vont être étudiés. Afin de mieux comprendre leur fonction nous étudierons l’effet de leur invalidation au cours de la gamétogenèse. Le second objectif de ce projet est d’identifier de potentielles causes génétiques d’infertilité. L’infertilité est une pathologie qui touche environ un couple sur six et dans de nombreux cas les causes en demeurent inconnues. Mieux comprendre les acteurs impliqués dans le processus de gamétogenèse et les mécanismes associés permettra de mieux diagnostiquer l’infertilité.

Bénéfices attendus

La fonction de reproduction est très particulière. C’est en effet une des premières à se mettre en place au cours du développement et une des dernières à devenir fonctionnelle à l’âge adulte (c.a.d. lorsqu’un individu souhaitera procréer). Il existe de ce fait une ‘boite noire’ entre le moment où cette fonction peut être altérée et le moment de la découverte de l’infertilité. Il est donc capital de prévenir autant que de ‘guérir’ toute atteinte à la fonction de reproduction et ceci implique une connaissance poussée des mécanismes biologiques impliqués. La compréhension du rôle des gènes est essentielle pour comprendre globalement la gamétogenèse, et donc ce qui assure la fertilité. Connaitre les gènes et comprendre les processus permettra d’identifier les causes génétiques et améliorera la prise en charge et le conseil apporté aux patients. Plus spécifiquement, notre projet améliorera cet aspect en apportant des connaissances fondamentales sur les étapes dérégulées lorsque des gènes impliqués en méiose sont invalidés. La méiose est le processus qui permet la formation des gamètes haploïdes (ovules et spermatozoïdes).

Procédures

Un biopsie de queue sera réalisé sur animal vigile afin de déterminer son statut génétique. La durée de cette procédure est de quelques secondes. Un prélèvement unique sera réalisé par animal. Celui-ci servira à déterminer le statut génétique de l’animal. En effet, afin d’étudier le rôle d’un gène dans la fonction de reproduction, nous produirons des animaux déficients pour ce gène à partir de croisements d’individus hétérozygotes (ne possédant qu’une copie sur deux du gène invalidés). Les descendants de ces animaux seront alors soit sauvages génétiquement (avec les deux copies du gène non mutées) soit hétérozygotes, soit homozygotes mutants (avec les deux copies du gène mutées). Nous allons comparer les tissus reproducteurs des animaux homozygotes à ceux des animaux sauvages pour comprendre l’effet de l’invalidation du gène candidat. Les animaux hétérozygotes serviront à maintenir la lignée. Exceptionnellement si le résultat de l’analyse génétique, n’est pas concluant, un second prélèvement peut être envisagé.

Impact sur les animaux

La biopsie de queue est un geste qui provoque une douleur légère. L’animal est maintenu en contention (pour éviter qu’il bouge) lors du prélèvement ce qui représente une source de stress.

Devenir

A l’issue de la procédure (prélèvement d’un morceau de queue) tous les animaux sont maintenus en vie. au-delà, les animaux dont le génotype ne convient pas seront euthanasiés et leurs tissus pourront être récupérés post-mortem. Les autres animaux seront maintenus en vie pour intégrer des projets de recherche nécessitant ce type d’animaux.

Remplacement

La fonction de reproduction ne peut être efficacement modélisée in vitro car elle implique plusieurs tissus et types cellulaires en interaction. De plus, l’étape centrale de la gamétogenèse, la méiose, est absolument impossible à mimer avec une lignée cellulaire. En effet, la méiose est une division cellulaire différente de la mitose qui ne permet pas la multiplication cellulaire et donc exclut l’usage d’une lignée cellulaire par définition. La souris est un modèle de choix pour l’étude de la fonction de reproduction du fait de son cycle rapide de reproduction et de l’existence de nombreux modèles mutants avec des phénotypes finement décrits dans la littérature facilitant la comparaison des données. A ce jour cette méthode, la biopsie de queue, est la seule parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire pour le génotypage des souris portant des constructions génétiques spécifiques. Ce processus est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et permettre l’entretien de ces lignées.

Réduction

Sur la base de notre expérience, nous avons estimé le nombre d’animaux requis pour l’étude de ces différents gènes en fonction des étapes supposées être atteintes. Le croisement d’animaux hétérozygotes permettra de générer à la fois des animaux homozygotes et sauvages dont les phénotypes seront comparés. L’étude du processus de reproduction dans les deux sexes simultanément devrait limiter la génération d’animaux non exploités. Les animaux hétérozygotes issus des mêmes croisements serviront à maintenir les lignées.

Raffinement

Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les souriceaux âgés de 10 à 21 jours sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place. Dans les cas exceptionnels ou une seconde biopsie serait requise au-delà de 21 jours, un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux au développement et à la reproduction rapides. Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines, notamment l’infertilité, car les souris possèdent de grandes similarités génétiques avec l'être humain. La production des cellules sexuelles est bien décrite dans cette espèce et il est donc aisé, par comparaison, de positionner le rôle d’un nouveau gène. Chez les vertébrés, il n’existe pas d’autre modèle dans lequel autant de mutations affectant la fertilité aient été décrites. Chez les organismes modèles invertébrés (levure, ver, mouche) de nombreuses mutations affectant la fertilité sont rapportées mais la conservation des gènes est relativement faible vis-à-vis de l’espèce humaine. Les biopsies de queues sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 10 jours. Le génotypage (pour visualiser le(s) gène(s) d’intérêt) des lignées est essentiellement réalisé à cet âge pour permettre d'avoir le résultat au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.