Système urogénital

452 hamsters dorés et 88 souris, soit 540 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements de tissus et d'organes. Jusqu'à 365 hamsters peuvent subir une opération d'environ deux heures, que le porteur juge "douloureuse et inflammatoire" sans dire en quoi elle consiste. Chaque semaine et pendant toute la procédure, des hamsters sont anesthésiés pour une mesure des testicules (432 d'entre eux) et une prise de sang (442), qui peut laisser ecchymoses, hémorragie ou infection, et ceux transférés en photopériode courte vivent ensuite seuls en cage. Certains passent des tests de mémoire et d'olfaction dont la méthode n'est pas décrite, et les 88 souris, que le porteur décrit comme mutées pour les récepteurs de la mélatonine, reçoivent toutes une injection éveillées 24 heures avant leur mise à mort. Le porteur juge l'étude de l'intégration des saisons par le système nerveux central "indispensable pour comprendre comment les différentes espèces, dont l'humain, s'adaptent aux cycles annuels de leur environnement".

Objectifs

Il est bien établi que les variations des concentrations de mélatonine nocturne permettent l’intégration des saisons au niveau de l’hypothalamus, une zone cérébrale connue pour contrôler la fonction de reproduction. L’hypothalamus comprend des cellules gliales spécifiques bordant le 3ème ventricule, appelées tanycytes, qui jouent un rôle important dans la physiologie saisonnière et dans la prolifération cellulaire. De récents résultats de l’équipe, obtenus chez le hamster syrien (rongeur saisonnier) indiquent que le nombre de cellules néoformées augmente rapidement après le transfert en photopériode courte (hiver, période de l’année où la durée du jour est plus courte que celle de la nuit). Cette augmentation de la prolifération cellulaire en photopériode courte a été préalablement observée chez une autre espèce saisonnière, la brebis et il a été montré qu’elle participait à la synchronisation saisonnière de la fonction de reproduction. La brebis se reproduit en photopériode courte (automne/hiver), contrairement au hamster qui se reproduit en photopériode longue (printemps/été), ce qui interroge sur le rôle de la prolifération cellulaire hypothalamique sur la fonction de reproduction du hamster. De plus, nous avons récemment observé que l’augmentation de la durée de production nocturne de mélatonine en photopériode courte entraine l’augmentation de cellules néoformées dans l’hypothalamus. De plus, notre étude montre également que la mélatonine n’agit pas classiquement via l’hormone thyroïdienne (T3) intra-hypothalamique, suggérant qu’elle pourrait agir directement via ses récepteurs MT1 et/ou MT2 , pour contrôler la prolifération cellulaire. Pour vérifier notre hypothèse d’un effet direct de la mélatonine, il est nécessaire d’utiliser des animaux génétiquement modifiés, présentant des mutations pour les récepteurs à la mélatonine (MT1 et/ou MT2), ce qui est possible uniquement chez la souris. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez le hamster syrien le rôle biologique de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus sur la synchronisation saisonnière de la reproduction, et d’établir chez la souris les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire saisonnière.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre d’une part, les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire hypothalamique, et d’autre part le rôle biologique de cette prolifération cellulaire saisonnière sur le contrôle annuel de l’activité de reproduction chez un mammifère saisonnier. En effet, la neurogenèse (formation de nouveaux neurones) chez les mammifères adultes est un sujet de recherche assez récent, c’est pourquoi la recherche des facteurs environnementaux influençant cette neurogenèse, comme ici les saisons, est nécessaire à la compréhension des mécanismes et du rôle biologique de celle-ci dans le cerveau adulte. Par ailleurs, ces travaux ont des implications cliniques car de plus en plus d’études montrent l’impact physiologique des saisons chez l’humain. Une étude a montré que les concentrations circulantes d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance varient selon les saisons. L’étude des mécanismes d’intégration des saisons dans le système nerveux central est donc indispensable pour comprendre comment les différentes espèces, dont l’humain, s’adaptent aux cycles annuels de leur environnement.

Procédures

Les hamsters pourront être soumis à une procédure chirurgicale (n=365, d’une durée d’environ 2h00) effectuée sous anesthésie générale. La mesure de la taille des testicules (n=432) et le prélèvement de sang (n=442) des hamsters (sera effectuée sous anesthésie générale hebdomadairement, d’une durée d’environ 2-3 minutes par animal, durant la totalité de la procédure. Certains hamsters seront soumis à des tests comportementaux (1 à 2 fois) afin d’évaluer la mémoire et l’olfaction (durée d’1 semaine pour chaque type de test). L’hébergement en cage individuelle aura lieu suite au transfert en photopériode courte jusqu’à la fin de la procédure expérimentale. La totalité des souris (n=88) et certains hamsters seront soumis à une injection sur animal vigile, une seule fois, 24 heures avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’intervention chirurgicale est jugée douloureuse et inflammatoire, et donc entrainer une perte de poids post-opératoire ; 2) la préhension de l’animal afin d’effectuer les injections intrapéritonéales pourra engendrer un stress et une irritation de la zone injectée ; 3) les prélèvements de sangs récurrents pourront induire une irritation, une douleur légère, des ecchymoses, une hémorragie, une compensation temporaire via le membre opposé pour se déplacer ou une infection ; 4) les tests comportementaux peuvent induire un stress aigu.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 540 animaux, soit 452 hamsters syriens et 88 souris. Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus et organes pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps. Par conséquent ce projet ne peut pas être réalisé chez des invertébrés, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques. Dans ce contexte nous ne pouvons pas proposé d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l’aide des tests statistiques appropriés. Les études préparatoires sont mises en place afin de maitriser et d’améliorer les gestes techniques ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux dans la procédure en elle-même. Dès que l’expérience s’y prête, un suivi longitudinal a été privilégié. C’est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs semaines, cela permet une réduction du nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les hamsters et les souris seront hébergés en groupes sociaux ou seront isolés, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress, les cages seront enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et avec apport d’eau et de nourriture à volonté et un tunnel. Ce tunnel sera utilisé pour déplacer les animaux lors du change ou pour capturer l’animal. Après leur arrivée à l’animalerie, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, ils seront manipulés quotidiennement pendant 1 semaine avant le début des procédures expérimentales. Toute procédure invasive est réalisée sous anesthésie/analgésie et après entrainement au geste technique. Tous les animaux seront observés et pesés hebdomadairement. Des points limites ont été établis afin de d’identifier les animaux en souffrance et de pouvoir les y soustraire.

Choix des espèces

Le hamster syrien est un modèle de rongeur saisonnier dont les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la physiologie saisonnière sont largement étudiés. De récents résultats ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique induite par un transfert en photopériode courte (hiver). Par conséquent, il est opportun d’utiliser la même espèce pour analyser le rôle biologique de cette prolifération saisonnière, d’autant que nous maitrisons les procédures expérimentales proposées chez cette espèce. Des injections quotidiennes de mélatonine pendant 1 semaine augmentent la prolifération cellulaire hypothalamique chez le hamster. La détermination de sites d’action de la mélatonine nécessite des individus mutés pour les récepteurs de la mélatonine. Comme nous ne disposons pas de ces outils génétiques chez le hamster, nous utiliserons des souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine. Pour cette étude, nous utiliserons des hamsters syriens jeunes adultes (3-8 mois), et des souris mâle jeunes adultes (7-8 semaines), période où la maturité sexuelle est optimale.

Produire des lignées de souris transgéniques, importées de banques internationales ou créées sur place par CRISPR-Cas9 : 2 185 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 450 d'entre elles et modéré pour les 735 autres. Des femelles reçoivent deux injections hormonales à 48 heures d'intervalle pour être superovulées, d'autres sont opérées sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes pour qu'on leur réimplante des embryons dans l'utérus, et des mâles sont vasectomisés par section des canaux qui transportent les spermatozoïdes. Le porteur attend des douleurs après l'opération abdominale et des complications de cicatrisation, infection, gonflement ou ouverture de la plaie. Les femelles superovulées sont tuées pour recueillir leurs embryons, les receveuses après gestation et allaitement faute d'appareil reproducteur intact, et les mâles vasectomisés lorsque leur capacité d'accouplement est jugée nulle, constatée après huit accouplements sans résultat.

Objectifs

Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste - À introduire au sein de notre animalerie des lignées de souris transgéniques déjà existantes dans des laboratoires extérieurs ou dans des banques internationales, par des techniques de reproduction assistée (ART). - En cas d’indisponibilité de ces modèles, créer de nouvelles lignées de souris transgéniques par des techniques de transgénèse notamment en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 , prix Nobel 2020

Bénéfices attendus

Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour tester les concepts permettant de développer de futures thérapies innovantes.

Procédures

Certaines femelles seront injectées 2 fois à 48H d’intervalle. Le geste ne dure que quelques secondes. D’autres femelles seront anesthésiées en vue d’être opérées pour une réimplantation d’embryons dans la cavité utérine (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes) Enfin, des mâles seront anesthésiés avant d’être opérés. L’opération consiste à couper les canaux qui transportent les spermatozoïdes (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même. Les femelles réimplantées avec les embryons ainsi que les mâles vasectomisés subissent une chirurgie. Une douleur est attendue à la suite de l’opération abdominale. Aussi la cicatrisation peut rencontrer certains problèmes : infection, gonflement, ouverture de la plaie

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les embryons à une cellule. Les mâles vasectomisés sont utilisés pour leur capacité d’accouplement. Ils sont mis à mort lorsque cette capacité est nulle, établie après 8 accouplements sans femelle accouplée. Nous transférons des embryons chez des femelles receveuses en effectuant une incision au niveau de l’appareil reproducteur. Ces souris ne présentent donc pas d’appareil reproducteur intact pour pouvoir être réutilisées pour une deuxième expérience. Elles sont mises à mort après avoir mené à terme leur gestation et allaitement

Remplacement

En amont du projet, les chercheurs effectuent systématiquement des analyses préalables in-vitro quand cela est possible (culture de cellules, organoïdes…). Cependant, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Nous favoriserons l'importation de modèles transgéniques déjà répertoriés et caractérisés dans des bases de données. Cependant, si le modèle n'est pas disponible, nous créerons un modèle innovant par les approches de transgénèse ou de FIV

Réduction

Nous avons optimisé nos procédures pour générer des modèles innovants de souris génétiquement modifiées. Nous associons la technologie CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020) à la technologie d’électroporation d’embryons pour le transfert de matériel génétique dans le noyau des embryons à une cellule. De nombreuses améliorations ont été apportées : • Optimisation des outils CRISPR/Cas9 grâce à des analyse in-silico • Choix des souches de femelles receveuses les plus adaptées pour recevoir ces embryons et mener à bien les gestations et les allaitements. Ces optimisations nous ont permis de diminuer d’un facteur 2 le nombre de souris donneuses et receveuses nécessaires à la création d’un modèle génétiquement modifié Nous avons également développé la technique de Fécondation In-Vitro (FIV), permettant la production de cohortes d'animaux de même âge tout en diminuant fortement le nombre d’animaux utilisé. Les approches de transgénèse et de reproduction assistée n’utilisent pas d’approche statistique.

Raffinement

L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale, par ailleurs des analgésiques permettent de prendre en charge la douleur liée à ces chirurgies. Un fluide réhydratant chauffé à 37°C est systématiquement injecté en fin de chirurgie afin d’éviter des problèmes de déshydration et permettre un réveil de qualité. Les souris opérées sont placées sur un tapis chauffant et reçoivent de la nourriture riche en graisses (9.9%) ainsi que des graines de tournesol disposées au fond de la cage. Cette disposition leur permet de se nourrir sans avoir à se mettre sur leurs pattes arrière et tirer sur leurs cicatrices. Les animaux seront surveillés pendant les 2 jours suivant l’opération pour vérifier que la cicatrisation se passe bien Il est extrêmement rare d’observer des complications dans ce types d’expériences. Néanmoins, la grille de score permettra l’arrêt l’expérience en cas d’observation d’une souffrance chez l’animal

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée - superovulation efficace et embryons faciles à injecter Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les femelles sont utilisées jusqu'à l'âge de 6 mois, tandis que les mâles sont utilisés jusqu'à l'âge de 12 mois.

652 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est irradiée aux rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds, une autre reçoit une irradiation à dose létale qui détruit son système sanguin et dont la mort survient en 11 à 15 jours sans greffe, une autre encore est stérilisée par un composé reprotoxique avant de recevoir une greffe de cellules souches testiculaires ou de moelle osseuse. Les données doivent servir à estimer les risques encourus par les astronautes lors de vols dans l'espace profond, sur la fertilité masculine, le système sanguin et le cerveau, et à améliorer la composition des capsules, des vêtements et du régime alimentaire des équipages. Sur le remplacement, le porteur indique que les cultures de cellules souches ne reproduisent ni la quiescence, ni les régulations hormonales, ni la réponse inflammatoire, et que seule la greffe chez un receveur vivant démontre le caractère "souche" d'une cellule.

Objectifs

Les vols spatiaux autour de la Terre ont des effets sur la santé qui ne peuvent être extrapolés aux séjours de longue durée dans l'espace profond. La Terre protège du rayonnement cosmique, un mélange complexe de radiations dont les éléments les plus toxiques sont les ions lourds. Des irradiations X ou photons répétées à faibles doses accélèrent le vieillissement et augmentent le risque de cancers. Mais il est impossible de transposer leurs effets aux faisceaux d'ions lourds plus toxiques pour les cellules. Ce projet vise à examiner les conséquences d'expositions à faibles doses sur la fertilité masculine (production de sperme), le système sanguin (risques de cancer) et le cerveau (dysfonctionnements). En l'absence de données, les risques encourus par les astronautes peuvent être analysés chez la souris adulte. Les effets des ions lourds seront comparés à ceux après irradiation obtenus dans la première partie du projet. Ces effets ne peuvent être identifiés dans des cultures de cellules qui ne reproduisent ni les régulations hormonales, ni les réponses inflammatoires, ni les interactions entre types cellulaires. Pour minimiser le nombre de souris, des tissus d'un même animal (testicules, moelle osseuse et cerveau) seront prélevés. L'accent est mis sur les cellules souches, présentes tout au long de la vie et essentielles à la production de cellules matures telles que les cellules sanguines et les spermatozoïdes, ainsi qu'au maintien du système nerveux. L'étude comprend des expériences de greffes afin d'examiner la capacité des cellules souches irradiées, testiculaires et hématopoïétiques, à produire respectivement des spermatozoïdes ou à induire des cancers chez les souris receveuses. Après immunohistologie des cerveaux irradiés, une reconstruction 3D permettra de visualiser et quantifier la production de neurones, les interactions cellulaires et l’inflammation afin d’améliorer la compréhension des disfonctionnements cérébraux observés. Différents prélèvements de sang et de tissus seront réalisés sur les souris euthanasiées pour mettre en évidence des différences entre souris irradiées et non irradiées via des dosages biochimiques, le suivi de marqueurs de stress, et l'analyse de l’expression géniques dans les tissus d'intérêt. Les procédures se dérouleront sous anesthésie et des antalgiques sont prévus avant et après les interventions. Une grille de suivi des points limites permettra de minimiser le stress et/ou la douleur chez les animaux greffés.

Bénéfices attendus

- L'analyse in vivo des effets de faibles doses d'irradiation reste délicate. Pour les radiations, des effets dégénératifs et cancérigènes ont été démontrés, mais les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas totalement élucidés. L'analyse comparée des cellules souches de 3 tissus soumis à des irradiations de natures différentes apportera des éléments de réponse complémentaires. - Il n'y a pas actuellement de données sur l'innocuité de l'exposition aux ions lourds à faible dose sur les cellules souches testiculaires. Ce travail permettra d'établir si elles conservent à moyen terme leurs propriétés de production de spermatozoïdes. Leur capacité à restaurer une spermatogenèse après exposition à un faisceau 56Fe sera un argument positif en faveur du maintien d'une fertilité masculine normale dans l'espace. Ces données préliminaires permettront d'analyser ensuite le risque héréditaire potentiel (génétique et/ou épigénétique) sur la descendance. - Une analyse immunohistologique en 3D des cerveaux des animaux irradiés permettra de préciser les types de cellules nerveuses altérées et l'influence de la réponse inflammatoire dans les disfonctionnements cognitifs. - Des expériences de greffes de cellules souches hématopoïétiques irradiées (impliquées dans la production des cellules sanguines) dans des animaux receveurs sains permettront de confirmer ou infirmer leur rôle dans le développement de leucémies - Pour chaque type de cellules souches, les analyses d'expression génique permettront de déterminer s'il existe ou non une signature spécifique des faisceaux de forte énergie par rapport aux irradiations de faible énergie, en fonction de la dose. Ces données serviront de base aux études ultérieures des effets d'une exposition chronique à de faibles doses de radiations, plus proche de la réalité mais techniquement impossible actuellement. Elles devraient permettre également d'améliorer les mesures de protection des équipages (composition des capsules, vêtements, régime alimentaire).

Procédures

Des groupes de souris mâles seront exposés une seule fois à des rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds et d'autres ne seront pas exposés (contrôle). Les conditions d’irradiation (en groupe, à l'obscurité avec bruit limité et sur une courte durée inférieure à10 min) induisent peu de stress et les doses d'exposition ne sont pas associées à de la douleur. Les souris réintègrent pour 7 jours leurs cages d'origine et font l'objet d'une surveillance régulière avant d'être euthanasiées. Les animaux receveurs sont préalablement stérilisés par injection d'un composé reprotoxique, suivi 24h après d'une greffe de moëlle osseuse pour maintenir leur système sanguin. Après 1 mois, les cellules souches testiculaires fluorescentes sont greffées (anesthésie chimique et durée 20 minutes). Deux mois plus tard, les testicules des receveurs euthanasiés sont prélevés et analysés pour déterminer la présence de spermatozoïdes fluorescents. Le système sanguin des souris receveuses est éliminé par une seule irradiation à forte dose et de la moëlle osseuse est greffée 24 h après (durée moins de 10 min). Les cellules souches des donneurs sont greffées 24 h après sous anesthésie gazeuse par une transfusion d’une durée de 5 min. Les animaux receveurs seront euthanasiés 4 mois plus tard pour permettre le prélèvement de tissus et organes et leur analyse.

Impact sur les animaux

- Le stress généré par la séance d'irradiation. De plus pour les souris irradiées à fort dose (dose létale, la mort est attendue entre 11 et 15 jours en absence de régénération du système sanguin. Signes préalables de souffrance : des problèmes oculaires, des dermatites, une perte de poids, une prostration, un pelage terne ou des vocalisations anormales. - La greffe hématopoïétique peut échouer chez les animaux traités par l'agent reprotoxique : perte de poids, prostration, vocalisation anormale. Après la transplantation de cellules testiculaires, ces animaux sont observés quotidiennement (sur 7 jours) afin de détecter la présence éventuelle de lésions cutanées, de réactions inflammatoires (suppuration), de signes de douleur ou de stress (poils hérissés, dos vouté, vocalisation anormale), et de signes d’infection. - Les différentes injections d'anti douleurs et anesthésiques peuvent également stresser les souris.

Devenir

Les animaux irradiés et contrôles non irradiés seront euthanasiés après 5 jours, pour permettre le prélèvement de tissus en vue d'analyses cellulaires ou génétiques, ou de greffes pour ceux exprimant la protéine fluorescente. Ces expériences sont destinées à déterminer les effets induits par l'irradiation : lésions dans l'ADN non réparées, mort cellulaire, arrêt de la multiplication des cellules et réduction des capacités de régénération des cellules souches. Les animaux receveurs de greffes intratesticulaires seront euthanasiés après 2 mois pour déterminer si les cellules fluorescentes greffées ont permis la régénération d’une spermatogenèse fonctionnelle (production de gamètes). Les animaux receveurs de greffes hématopoïétiques seront euthanasiés après 4 mois pour prélever et analyser leur moelle osseuse. En absence de production de cellules sanguines fonctionnelles à partir des cellules greffées, le décès des receveurs survient habituellement dans les 2 semaines suivant la greffe. Dès la détection de signes cliniques de souffrance, les animaux seront euthanasiés; et leur moelle osseuse sera analysée.

Remplacement

1) Les modèles alternatifs de culture de cellules souches de souris ne permettent pas de modéliser leur microenvironnement en conditions physiologiques, ni de reproduire l'absence de multiplication (quiescence) d'une grande partie du stock de cellules souches. Ces modèles de substitution ne peuvent rendre compte des régulations hormonales, et de la réponse inflammatoire susceptible d'être induite après irradiation. L’utilisation d’un modèle animal reste ici nécessaire pour évaluer l’effet des radiations sur un organisme. (2) La validation ultime du caractère "souche" des cellules ne peut être établie que par transplantation (greffe) de cellules chez un receveur, qui est le seul moyen de démontrer la capacité d'une cellule à restaurer une différenciation normale (propriété des cellules souches) en conditions physiologiques et assurer une régénération tissulaire.

Réduction

Les irradiations "corps entier" associées à l’étude de 3 tissus d’un même animal permettent de limiter notablement le nombre d’animaux impliqués dans ce projet. Un programme de modélisation prenant en compte les différents paramètres importants de l’expérience est utilisé pour estimer la taille des groupes expérimentaux. Il offre le meilleur ratio de probabilité de réussite dans la comparaison de groupes de petits effectifs par des tests statistiques classiques.

Raffinement

L’irradiation corps entier n’induit pas de de stress particulier, car elle est de courte durée et réalisée en groupe. Les animaux bénéficient de conditions d'hébergement enrichies (Tunnel, coton pour la nidification) et sont maintenus par paires. Des protocoles d’anesthésie/ analgésie sont en place pour minimiser la douleur. Un suivi hebdomadaire sera effectué et en cas de signes de souffrance (d’après une grille d’évaluation de l’état général) le vétérinaire sera alerté. Un traitement symptomatique pourra être mis en place, puis une euthanasie sera pratiquée si aucune amélioration n'est observée.

Choix des espèces

La souris est le modèle mammifère le plus fréquemment utilisé à cause de ses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques avec l’Homme. Animal de petite taille, son temps générationnel est court. C'est également un modèle de référence en radiobiologie. Les membres des équipages exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 8 à 12 semaines. L'étude de la spermatogenèse implique que l'ensemble des animaux soient des souris mâles. Les astronautes exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 2 à 3 mois . Les animaux receveurs destinés aux procédures 2 et 3 auront de 7 à 9 semaines pour tenir compte des chronologies expérimentales (délai de stérilisation : 1 mois; analyse post greffe : 2 à 3 mois pour la spermatogenèse, 2 à 4 mois pour l'hématopoïese).

Jusqu'à treize anesthésies en dix jours pour une même souris : 260 souris vont être utilisées, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 100 un niveau modéré. Elles sont épilées, reçoivent des bactéries en injection dans la mamelle, parfois une sonde fluorescente dans la veine de la queue, et certaines sont gavées tous les jours pendant deux semaines. Le modèle sert à étudier l'immunité mammaire des ruminants, le porteur indiquant que le passer chez la souris évite "des protocoles plus dommageables sur des espèces telles que la brebis". Les mères infectées sont tuées pour mesurer la charge bactérienne dans leur glande mammaire, et leurs souriceaux le sont aussi, l'allaitement s'interrompant avant le sevrage sans possibilité d'adoption dans la zone d'expérimentation.

Objectifs

L'occurence des mammites dans les élevages représente un problème majeur en santé animale. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'immunité mammaire est nécessaire pour améliorer la santé et le bien-être des animaux d'élevage, ainsi que la qualité (nutrionnelle, microbiologique...) des produits d'origine animale tout en réduisant le recours aux intrants chimiques dont les antibiotiques.

Bénéfices attendus

Le caractère inédit du protocole mis en place, ainsi que l'utilisation d'une technique d'imagerie innovante permettront d'apporter des informations de grande importance dans le domaine de l'immunité mammaire. De plus, la mise en place de ce modèle chez la souris évite l'application de protocoles plus dommageables sur des espèces telles que la brebis.

Procédures

Les souris sont anesthésiées par inhalation d'un anesthésiant à plusieurs reprises : - une fois pour leur épilation, pour une durée maximale de 20 minutes - une fois pour les injections intra-mammaires pour une durée maximale de 30 minutes - potentiellement une fois pour une injection de sonde fluorescente pour une durée maximale de 15 minutes - une fois par jour pour les analyses pour une durée maximale de 15 minutes, durant la durée du protocole (durée maximale de 10 jours), soit un nombre maximal de 13 anesthésies. Les souris sont également soumises à des injections de bactéries intra-mammaires (sous anesthésie gazeuse comme indiqué ci-dessus) qui durent environ 5 à 10 sec. Elles seront aussi potentiellement soumises à une injection de sonde fluorescente (sous anesthésie gazeuse comme indiqué ci-dessus) dans la veine caudale des souris qui doivent durer environ 5 à 10 sec. Enfin, elle subissent une euthanasie à la fin du protocole. Pour le deuxième projet, les souris sont prélablement gavées quotidiennement pendant 2 semaines, la durée de l'intervention est d'environ 5 à 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés lors des expériences d’infections réalisées à ce jour dans le cadre de ce projet ont montré une légère perte de poids mais cette perte s'est rapidement résorbée au cours de l'expérimentation. Des signes de prostration ont pu être observés sur certaines souris après réveil suite aux injections mais n'étaient plus visibles dès le 1er jour post-infection. Aucun autre signe de souffrance ou d'altération du bien-être des animaux n'a pu être observé au cours de ces expériences.

Devenir

Les souris adultes sont euthanasiées à la fin des expériences afin de pouvoir faire des prélèvements de glande mammaire dans le but de faire des mesures de charge bactérienne. De plus, l'infection subie par les animaux induit une modification de leur statut immunitaire ce qui empêche leur utilisation dans de nouvelles expériences d'infection qui nécessitent l'utilisation d'animaux n'ayant jamais été infectés. Les souriceaux sont également euthanasiés car l'interruption de la lactation survient avant le sevrage (du fait de l'euthanasie des mères) et il n'est donc plus possible de les maintenir en vie du fait de l'impossibilité de réaliser des adoptions et des déplacements d'animaux dans une nouvelle zone à cause des spécificités de la zone d'expérimentation.

Remplacement

Les infections expérimentales réalisées chez la souris ont pour but la compréhension du rôle d'une protéine et de l'administration d'alicaments sur la sévérité et l'issue de l'infection, ainsi que le recrutement des cellules immunitaires. Ces expériences ne peuvent être réalisées qu'à l'échelle de l'organisme d'animaux vivants et ne peuvent être reproduites in vitro puisqu'elles impliquent des interactions entre les différents acteurs du système immunitaire de l'organisme, après contact avec les bactéries en multiplication. Elles permettront ainsi une analyse pertinente et complète du point de vue physiopathologique, dont les résultats seront à priori plus fiables et auront une plus grande probabilité d'être transférables aux espèces de ruminants.

Réduction

Cette technique d'imagerie a été choisie car elle est non invasive et qu'elle permet d'analyser plusieurs paramètres simultanément sur les mêmes souris tout en réalisant une cinétique de suivi de l'infection. Cette méthode permet donc de limiter grandement le nombre d'animaux utilisés pour obtenir un grand nombre d'informations sur les mêmes souris : intensité de l'infection et du recrutement des cellules immunitaires à différents temps post-infection. Des premiers essais tests seront réalisé sur des lots successifs de nombres réduits d'animaux pour optimiser les conditions expérimentales au fur et à mesure et ajuster la cinétique pour avoir le maximum d'information et de fiabilité des résultats tout en limitant au mieux la durée du protocole et la souffrance des animaux. Les expériences seront ensuite réalisées sur des lots successifs de souris et les résultats obtenus analysés à l'aide de tests statistiques pour évaluer leur fiabilité, et ainsi déterminer la nécessité ou non d'augmenter les effectifs examinés pour l'obtention de résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Les anesthésiques choisis sont peu toxiques et permettent ainsi une anesthésie de courte durée pour les analyses (15min maximum) et le réveil rapide avec une reprise immédiate de l'activité. L'infection des souris se fera par injection intra-mammaire, geste non traumatisant pour la glande mammaire. Le nombre d'analyse sera limité à un ou deux par jour et un suivi régulier des animaux sera effectué pendant toute la durée du protocole. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, dont la gravité sera évaluée en fonction des points limites pré-établis, sera exclu de l'étude puis euthanasié.

Choix des espèces

Les protocoles de modifications génétiques sont beaucoup plus faciles à mettre en place chez la souris que dans les autres espèces. La souris a donc été choisie pour créer un modèle d'intérêt de souris génétiquement modifiées. De plus, la grande majorité des données publiées sur l'immunité et les thématiques d'intérêt des projets d'intérêt ont été acquises chez la souris. Il est donc nécessaire de prolonger les analyses dans la même espèce afin de pouvoir s'appuyer sur les résultats déjà obtenus pour la réalisation des protocoles et pour compléter les données pré-existentes tout en ayant des points de référence. Enfin, l'utilisation de la souris permet d'éviter la mise en oeuvre de protocoles beaucoup plus dommageables sur des espèces telles que la brebis. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, entre 14 et 16 semaines, puisqu'elles doivent être en lactation.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, un même animal pouvant enchaîner des injections intrapéritonéales répétées, l'ablation de ses ovaires, la pose d'un implant hormonal, douze semaines de régime obésogène, un jeûne, puis un gavage avant sa mise à mort. 160 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Le porteur range dans les actes "peu invasifs, indolores" la pesée et le régime riche en lipides, classe la biopsie d'oreille en douleur légère de courte durée, et signale que l'isolement des mâles après accouplement engendre un stress. L'objectif est de comprendre le rôle du récepteur des œstrogènes dans les vaisseaux lymphatiques, et les retombées avancées sur l'infertilité et l'obésité sont formulées comme des pistes, quand les ovariectomies et les gavages, eux, sont programmés.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Une dysfonction de ce système aboutit à la formation de lymphoedème, à une accumulation massive de fluide et de tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoedèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes concernant le rôle du système lymphatique dans le système reproductif (utérus, ovaires..) pour comprendre les problèmes d'infertilité. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le rôle du système lymphatique dans l'obésité, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'interventions: - Biopsie d'oreille pour identification et génotypage des bébés nés (quelques secondes)- Injections intrapéritonéales (2 à 3 secondes), gavage ( 5 secondes) - Ovariectomie (20 minutes de chirurgie sous plaque chauffante) et pose de pellet ( 10 minutes sur plaque chauffante) - Mise sous régime obésitogène ( 12 semaines) - Mise à jeun ( 2 heures) - Le même animal peut subir des injections intra-péritonéales répétées à un jour d'intervalle , suivie d'une ovariectomie et de la pose du pellet, puis mis sous régime obésitogène, avant de subir un gavage avant euthanasie . Il peut aussi subir un prélévement sanguin, mais cela sera fait sous anesthésie avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives, indolores (pesée, régime riche en lipides) ou de douleur légère de courte durée (biopsie d'oreille par poinçon), de classe légère et modérée (biopsie de queue, jeûne, ovariectomie, pose de pellet). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime riche en lipides peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Mise à jeun peut entrainer du stress - Ovariectomie/pose de pellet peut générer une douleur due à la chirurgie mais qui sera traitée par un analgésique et pris en compte par une surveillance accrue. - Isolement des mâles après accouplement va aussi engendrer un stress chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les différents tissus notamment les tissus adipeux, la peau, l'utérus, la glande mammaire qui permettront d'étudier le rôle d'ERa dans le système vasculaire lymphatique.

Remplacement

Les effets pléiotropes des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, l'étude de la fertilité impliquant la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la prise de poids et la réponse à un régime obésitogène d'un point de vue physiologique est difficile à modéliser dans sa globalité car elle fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité des femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème et le lipoedème qui touche une majorité de femmes. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cages de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la lactation, et de la prise de poids en réponse à un régime obésitogène. De plus, c'est le modèle qui permet d'étudier spécifiquement une invalidation génique de notre protéine d'intérêt de manière tissu-spécifique (système CRE-LOX).

Lavages vaginaux quotidiens pendant huit à vingt jours, que le porteur reconnaît "désagréables pour les femelles", inoculations intravaginales sous anesthésie, six prélèvements de sang à la queue, pose d'une puce sous la peau et tests de comportement sexuel répétés jusqu'à huit fois : 6 227 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 427 d'entre elles et modéré pour 2 800. 5 227 sont tuées, notamment les femelles dont il faut examiner les ovaires, les embryons et les organes génitaux, et 1 000 mâles sont gardés vivants pour être réutilisés d'un fragment d'anticorps à l'autre. Le projet teste des fragments d'anticorps de camélidés censés contrôler la reproduction sans toucher au comportement sexuel. Le porteur le présente comme mené "à des fins strictement scientifiques", tout en visant des alternatives à la contraception hormonale et des méthodes de synchronisation et de superovulation pour les animaux d'élevage.

Objectifs

Les méthodes actuelles de contrôle de la reproduction (traitements hormonaux, stéroïdes) sont associées à de nombreux effets secondaires, et les molécules utilisées s’accumulent dans l’environnement où elles agissent comme des perturbateurs endocriniens. Par ailleurs, aucune solution thérapeutique n’existe pour la prise en charge des troubles du comportement social, et les contraceptifs peuvent être associés à une diminution de la libido. La prise en charge des patients souffrant de troubles de la reproduction et du comportement, ainsi que la maîtrise de la reproduction des animaux d’élevage, bénéficieraient donc du développement de nouveaux traitements pharmacologiques. Les anticorps monoclonaux représentent une des meilleures promesses thérapeutiques dans le domaine de la reproduction. Les fragments d’anticorps de camélidés (VHH) présentent des caractéristiques uniques : ils ont une durée de vie courte dans le sang, sont dégradables et capables de moduler l’activité des récepteurs, et sont donc une alternative majeure aux composés chimiques et hormones stéroïdiennes. Nous caractérisons in vitro des VHH capables d’activer ou inhiber l’activité de cibles impliquées dans le contrôle de la reproduction et/ou du comportement sexuel localisées dans les gonades : récepteur de l’hormone folliculo-stimulante (FSHR), récepteur de l’hormone lutéinisante (LHR), récepteur des oestrogènes couplé aux protéines G 1 (GPER). Les VHH les plus prometteurs doivent désormais être développés pour un usage in vivo, afin de déterminer leur potentiel thérapeutique. Le projet proposé a pour objet i) de déterminer la pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo de ces fragments d’anticorps, ii) le cas échéant de procéder à une ingénierie de leurs séquences pour leur utilisation in vivo, iii) de déterminer les effets fonctionnels sur la reproduction et le comportement chez la souris de ces nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes, le tout à des fins strictement scientifiques. Le projet a ainsi pour objectif de démontrer la faisabilité de l’utilisation in vivo de VHH pour contrôler et moduler la fonction de reproduction sans affecter le comportement sexuel dans le cadre i) du développement d’alternatives aux méthodes actuelles de contraception, ii) du traitement de troubles de la reproduction, ou iii) du développement d’alternatives aux méthodes de contrôle de la reproduction (synchronisation, induction de l’ovulation, …) utilisées en élevage.

Bénéfices attendus

En cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des troubles de la reproduction, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables, ii) le développement de méthodes de contraception non hormonales qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels, tout en préservant l’environnement de l’accumulation de perturbateurs endocriniens à très longues demi-vies, iii) le développement de nouvelles méthodes non hormonales pour la synchronisation et l’induction de superovulation chez les animaux de rente.

Procédures

- Test d’interaction sociale réciproque : le test d’une durée de 10 minutes sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis 1 fois au test. - Test des trois chambres : le test sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis à 1 session de 10 minutes à J-2, 1 session de 10 minutes à J-1, et 2 sessions de 10 minutes à J0. - Test de comportement sexuel : le test sera réalisé avec des animaux vigiles et aura une durée maximale d’une heure. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis : i) 3 fois au test à 4 jours d’intervalle, ii) 2 fois au test à 2 semaines d’intervalle, iii) 8 fois au test, ou iv) 1 fois au test. - Pesée : la procédure sera réalisée avec des animaux vigiles et dure moins de 5 minutes par animal. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour pendant environ 25 jours. - Puçage : la procédure sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, et une injection sous-cutanée d’anesthésique sera réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Chaque animal sera soumis une seule fois à la procédure. - Lavages vaginaux : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis à la procédure pendant 16-20 jours ou pendant 8-10 jours. - Injection intrapéritonéale : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure. - Prélèvements sanguins par la queue : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sur animal vigile avec une anesthésie locale. Chaque animal sera soumis 6 fois à la procédure, à 1h, 12h, 2 jours, 5 jours et 7 jours d’intervalle du premier prélèvement. - Inoculation intravaginale : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure.

Impact sur les animaux

Les injections en intrapéritonéale, en intraveineuse et en sous-cutané ainsi que les prises de sang à la veine caudale peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site. La pose d’une puce RFID sous anesthésie générale peut engendrer une légère douleur au niveau du site de l’incision lors du réveil de l’animal. La contention des animaux génère du stress. Les tests d’interaction sociale peuvent entrainer une certaine agressivité entre les animaux et ces tests comportementaux peuvent être anxiogènes lié à l’environnement nouveau. Les lavages vaginaux sont des actes désagréables pour les femelles.

Devenir

Pour le génotypage et phénotypage des animaux transgéniques, les femelles doivent être euthanasiées pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires ainsi que les gonades et organes accessoires. Les mâles seront également euthanasiés car aucuns animaux de ces génotypes ne seront utilisés par la suite, et nous ne pouvons pas envisager de les replacer étant donné que nous ne connaissons pas à l’avance leur phénotype. Pour la mise au point de l’analyse automatisée des tests de comportement sexuel, les femelles ovariectomisées seront euthanasiées à l’issue de la procédure car elles ne seront pas réutilisées par la suite. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la cyclicité et le comportement sexuel des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin de déterminer si l’oestrus est ovulatoire ou anovulatoire, et pour pouvoir étudier les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la fertilité des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin d’étudier les paramètres embryonnaires, et pour pouvoir peser et étudier les organes accessoires et les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps sur la mobilité spermatique, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires. Toutefois, si aucune gestation n’est constatée, les femelles seront gardées en vie pour être réutilisées.

Remplacement

Tous les VHH utilisés ont été entièrement développés et caractérisés in vitro, mais aucune étude de reproduction ou de comportement ne peut se réaliser par des approches in vitro, ex vivo ou de modélisation. Ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et/ou comportementales, qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. La gestation ne peut être mimée in vitro, et l’activité neuronale à l’origine des comportements socio-sexuels est dépendante de l’interconnectivité des neurones, ces phénomènes ne peuvent donc être étudiés que sur des animaux entiers. De plus, la pharmacocinétique (demi-vie dans la circulation sanguine ou temps de résidence dans les organes cibles), la pharmacodynamique (effets des substances injectées sur leur cible), les effets secondaires éventuels et les effets fonctionnels des VHH sur la reproduction ou les comportements ne peuvent être évalués que chez l’animal. Compte tenu de l’ensemble de ces paramètres et de l’absence de méthodes de remplacement in vitro, il est indispensable de recourir à une expérimentation in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. Un effectif de 16 animaux par groupe est ainsi nécessaire. Toutefois, il est indispensable de prendre en compte un certain nombre de facteurs de variabilité pouvant conduire à l’élimination de certains animaux de l’expérience. Ainsi, afin d’assurer un effectif exploitable de 16 animaux par groupe en fin d’expérience, nous avons besoin d’un nombre total de 20 animaux expérimentaux par groupe. De plus, nous avons fait le choix de regrouper certains tests dans une même expérimentation, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour étudier ces paramètres. Enfin, les effectifs décrits correspondent aux effectifs maximaux qui pourraient être utilisés. En effet, dès que cela sera possible, plusieurs aménagements nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences : i) pour les tests de comportement sexuel, les mâles pucés pourront être réutilisés pour les expériences avec différents VHH, ii) pour les femelles ayant reçu une administration intravaginale de VHH, si aucune gestation n’est constatée au bout de 20 jours après mise en présence du mâle, celles-ci seront gardées en vie et réutilisées pour tester d’autres VHH, iii) dès que cela sera possible, plusieurs fragments d’anticorps candidats seront testés en parallèle avec un seul groupe contrôle commun, ce qui permettra de réduire les effectifs totaux des animaux contrôles utilisés. Enfin, concernant les animaux exprimant le transgène FSHR humain, si ceux-ci ne présentaient pas de restauration de la fertilité, aucune expérience ultérieure avec ces animaux ne serait réalisée.

Raffinement

Les expériences sont menées dans les plus courts délais possibles afin de minimiser l’inconfort et le stress des animaux et de les remettre dans leurs cages en présence de leurs congénères. Les animaux sont observés quotidiennement et leur état de bien-être déterminé sur la base de 3 critères : apparence, poids, comportement (critères décisionnels en annexe). Un enrichissement est mis en place dans l’arène utilisée pour les tests de comportement : cabane en plastique rouge, copeaux, biberon, gamelle de croquettes. Des phases d’habituation sont réalisées avant les tests de comportement, qui sont effectués à faible intensité lumineuse pour limiter l’anxiété des animaux. Ces derniers sont transférés dans une salle contigue à la salle de tests comportementaux 1h avant le début des procédures. Avant d’euthanasier des animaux, ceux-ci sont transférés un à un dans la salle dédiée, afin d’éviter une communication d’anxiété entre congénères. Les puces RFID sont insérées sous la peau au moins 1 semaine avant le début des expériences sous anesthésie gazeuse et une anesthésie locale est réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Pour les tests de cyclicité, nous réalisons de simples lavages au liquide physiologique plutôt que des frottis vaginaux à proprement parler (qui nécessitent l’introduction de petits coton-tiges à l’intérieur du vagin), cette méthode étant suffisante à la réalisation des objectifs scientifiques tout en limitant l’inconfort des animaux. Une anesthésie locale est réalisée pour les prélèvements de sang ainsi qu’en cas d’injections répétées des fragments d’anticorps. Les administrations intravaginales d’anticorps seront réalisées sous anesthésie générale de courte durée et les animaux sont placés sur un tapis chauffant au cours de la procédure. Les animaux sont soigneusement examinés jusqu’à leur réveil total et contrôlés 2 fois par jour après l’opération pendant 15 jours, pour détecter tout signe de douleur ou d’infection. En cas de signes, le responsable du bien-être animal serait immédiatement informé et les animaux traités. Si le traitement ne fonctionnait pas dans les 24 heures, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. L’hébergement des femelles gestantes sera enrichi avec des cotons de ouate. Lors de l’introduction des mâles avec les femelles, nous surveillons l’absence de comportements agressifs pendant 1 heure puis quotidiennement. En cas d’agressivité du mâle envers les femelles, celui-ci serait remplacé.

Choix des espèces

La souris est une espèce sociale qui se reproduit bien et vite, dont la physiologie de la reproduction est bien caractérisée, et qui présente de façon innée des comportements socio-sexuels bien décrits. Cette espèce permet la génération d’animaux modèles transgéniques (souris « humanisées » pour une cible dans le cas présent), approches qui ne sont pas ou que peu possibles sur d’autres espèces. Par ailleurs, à l’heure actuelle seules des petites quantités de VHH sont produites au laboratoire, compatibles uniquement avec une utilisation in vivo chez la souris. Les études seront réalisées chez l’animal adulte (à partir de 7 semaines), les animaux devant avoir passé la puberté pour pouvoir étudier leurs paramètres reproducteurs et comportements sexuels.