Troubles nerveux

Opérées du cerveau pendant trente à quarante minutes, 276 souris reçoivent d'abord une injection de produit chimique qui tue les neurones d'une zone du striatum, puis une greffe de cellules nerveuses humaines au même endroit. Certaines subiront deux interventions crâniennes espacées de sept à trente jours, si la greffe ne survit pas à la première formule testée. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes seront tuées, de deux semaines à cinq mois après la greffe, pour prélever leur cerveau. Le porteur écrit recourir à l'anesthésie et aux antidouleurs "afin d'éviter toute douleur", et reconnaît plus loin que les conséquences d'un rejet de greffe sur le bien-être de la souris sont encore mal comprises.

Objectifs

La greffe de cellules nerveuses issues de cellules souches humaines est une méthode prometteuse pour traiter des maladies du cerveau comme la maladie de Huntington. Ces cellules sont conçues pour remplacer celles détruites par la maladie. La plupart du temps, ces greffes utilisent des cellules provenant d’un donneur différent du patient, car c’est moins coûteux. Cependant, ce type de greffon cellulaire est attaqué par le système immunitaire du patient, ce qui peut entraîner un rejet. Pour éviter cela, on utilise des médicaments qui affaiblissent le système immunitaire, mais ces traitements augmentent les risques d’infections et de cancer. Une autre solution consiste à modifier génétiquement les cellules greffées pour qu’elles passent inaperçues auprès du système immunitaire. Ce procédé, appelé "camouflage immunitaire", pourrait permettre d’éviter au patient greffé de prendre les médicaments qui affaiblissent le système immunitaire. Le but de ce projet est de tester différentes façons de rendre ces cellules greffées plus tolérables pour le système immunitaire. Pour cela, on modifie les cellules pour qu’elles libèrent des substances qui apaisent le système immunitaire ou qu’elles soient moins facilement détectées. Nous comparerons la survie, après leur greffe dans le cerveau de modèles animaux rongeurs (souris), de ces cellules nerveuses modifiées génétiquement, en regardant si elles sont attaquées ou non par le système immunitaire. Nous étudierons aussi l’influence du stade de développement des cellules au moment de la greffe. Ces expériences seront réalisées sur des souris présentant un système immunitaire actif ou déficient, afin d’évaluer la survie des greffons testés en l'absence de tout rejet immunitaire. Ce projet marque une première étape dans l'évaluation de cette stratégie avant de procéder des essais cliniques, sur l'être humain.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels utilisant des cellules souches pour soigner des maladies comme Parkinson et Huntington nécessitent souvent des greffons cellulaires établis à partir de cellules provenant d'un donneur, et non du patient lui-même. Comme ces cellules sont différentes de celles du patient, le corps peut les rejeter. Pour éviter cela, les patients doivent prendre des médicaments qui affaiblissent leur système immunitaire, mais généralement seulement pendant un an, car ces médicaments peuvent causer de graves effets secondaires. Malheureusement, une fois le traitement arrêté, les greffons sont souvent rejetés, ce qui stoppe leur efficacité. Pour résoudre ce problème, des chercheurs explorent une idée innovante : modifier les cellules des greffons grâce à des techniques génétiques pour qu'elles soient "invisibles" au système immunitaire. Cela s’appelle l’immuno-camouflage. Cette étude vise à tester cette idée chez des souris, en évaluant différentes modifications génétiques pour trouver celles qui fonctionnent le mieux. Les bénéfices attendus sont : - Identifier une stratégie de modifications génétiques parmi plusieurs qui permettrait au greffon cellulaire de mieux survivre et d’être moins rejeté par le système immunitaire des souris. - Confirmer l’efficacité des meilleures options identifiées, avec différents types de cellules nerveuses et stades de développement des greffons, pour affiner les résultats. A court terme, le bénéfice attendu est d’identifier la meilleure stratégie pour éviter le rejet des greffons. Cette méthode de l’immuno-camouflage pourra ensuite être testée chez des modèles animaux primates. À plus long terme, des essais cliniques chez l’être humain pourraient être envisagés afin de confirmer l'efficacité de la stratégie de l’immuno-camouflage sur la tolérance de greffon de cellules nerveuses chez les patients. L’objectif final est de développer des greffons dont la survie et donc l’effet thérapeutique ne dépendent plus de traitements qui affaiblissent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des traitements plus sûrs et efficaces pour les maladies neurodégénératives.

Procédures

Tous les modèles animaux, soit 276 souris, subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 30 à 40 minutes sur le cerveau pour transplanter le greffon d'une durée d’une heure. Cette intervention impliquera une anesthésie et une analgésie générales et locales. Une première injection en 3 minutes d’un composé chimique pour induire la mort des neurones de la région ciblée permettra de mimer les pertes neuronales observées dans la maladie de Huntington. Pendant la même opération, une deuxième injection de cellules nerveuses en 6 minutes, soit contrôles, soit modifiées génétiquement pour être invisibles au système immunitaire, sera effectuée au même endroit. Certains animaux contrôles ne subiront que la première injection (lésion). Si les premières expériences de transplantation révèlent que la survie des cellules greffées est compromise par l’injection préalable du composé chimique induisant la mort des neurones lors de la même opération, cette dernière sera soit supprimée (première option testée), soit effectuée 7 à 30 jours avant l’injection des cellules, lors d’une autre intervention chirurgicale de 30-40 minutes sur le cerveau et selon la même procédure (option envisagée si la première échoue). Dans ce dernier cas, les animaux subiront deux interventions chirurgicales. Aucune intervention autre que le suivi de l’aspect et du poids ne sera effectuée sur les animaux jusqu’à leur mort provoquée par injection d’euthanasiant, entre 2 semaines et au plus 5 mois après la greffe.

Impact sur les animaux

Tous les modèles animaux qui participent à l'étude subiront une ou au maximum deux opérations chirurgicales du cerveau. Pour cela, nous utilisons une anesthésie générale et des antidouleurs (généraux et locaux) afin d’éviter toute douleur. Cette opération, peut entraîner des effets secondaires chez les souris, comme le stress, la fatigue, une légère baisse de température corporelle, la déshydratation, des douleurs, une petite perte de poids et un risque d'infection à l'endroit de l'opération. Ces effets ne sont pas systématiques, restent faibles et ne durent que quelques heures (pour le stress, le froid, la déshydratation) ou quelques jours après l'opération. La mort des neurones par procédé chimique d'un seul côté du striatum (une zone du cerveau) pourrait entraîner des difficultés permanentes de mouvement et compromettre la prise de poids normale des souris en vieillissant. Cependant, la dose de composés chimiques que nous prévoyons d’utiliser est trois fois inférieure à celle décrite dans la littérature, qui décrit une perte de mobilité de deux tiers. La greffe additionnelle de cellules nerveuses dans le striatum n’aggrave pas les effets négatifs de la mort des neurones ; au contraire, elle pourrait même les réduire. Les conséquences d'un rejet des cellules greffées dans le cerveau sur le bien-être de la souris sont encore mal comprises. Elles pourraient se manifester par des problèmes neurologiques et de comportement pendant plusieurs semaines ou jusqu’au rejet complet de la greffe (moins d'activité, perte de poids, stress). Nous surveillerons attentivement ces signes lors des premières analyses pour pouvoir ajuster notre suivi et nos décisions, en collaboration avec le vétérinaire de l'animalerie afin d’éviter toutes souffrances.

Devenir

Afin de caractériser l’intensité du rejet immunitaire des différents greffons cellulaires testés (ou l'absence de rejet pour les animaux contrôles présentant un système immunitaire déficient), nous devons récupérer les cerveaux des animaux greffés et/ou présentant une lésion cérébrale induite par procédé chimique en fin d'expérience. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude histologique permettra ensuite de reconnaître les cellules du greffon et celles du système immunitaire de la souris ayant envahi le greffon (signe de rejet immunitaire en cours) ou l’absence totale de cellules greffées (signe de rejet complet du greffon). La comparaison de ces analyses histologiques nous permettra d’identifier les stratégies de camouflage immunologique les plus efficaces.

Remplacement

La réaction immunitaire d’un organisme face à un greffon étranger mobilise différents acteurs cellulaires et moléculaires de la réponse immunitaire, ce qui rend très difficile sa modélisation complète in vitro. Uniquement certains aspects de la réaction contre des cellules immuno-camouflées est modélisable in vitro. Il est possible d’observer la réaction de cellules immunitaires humaines immortalisé en en contact avec un greffon. Ces expériences évaluent si elles s’activent ou produisent des substances signalant une réaction. Toutefois, ces méthodes sont jugées moins représentatives que celles qui utilisent des cellules immunitaires du sang. Cette méthode à partir de prélèvements sanguin est dite ex vivo, et permet de tester certains aspects de la réaction contre un greffon immuno-camouflées dont : 1) La caractérisation in vitro des molécules produites par les cellules immunitaires du sang de receveurs en présence de cellules du greffons ; 2) l’évaluation de la prolifération de ces cellules, signe d’une réponse immunitaire active en présence du greffon ; 3) la mesure de la mort cellulaire des greffons lorsque il est présenté aux cellules immunitaires purifiées issues du sang de receveurs. Les études avec de sang de macaque sont considéré comme de l’expérimentation animale et donc pas une étude de remplacement. Par ailleurs, plusieurs limitations associées à ce type d’étude ex vivo imposent la réalisation d’études in vivo parallèles : 1. Complexité du microenvironnement cérébral :les tests ex vivo ne permettent pas de reproduire le microenvironnement complexe du cerveau. Ils ne tiennent notamment pas compte de la barrière entre le sang et le cerveau, ni de la présence de cellules microgliales présentes uniquement dans le cerveau, mais qui contribuent de manière significative à la réaction immunitaire cérébrale. 2. Dynamique temporelle de la réponse immunitaire : les tests ex vivo sont courts (quelques jours), ils ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire après une exposition prolongée. 3. Réponse immunitaire systémique : les tests ex vivo ne permettent pas de mesurer la mobilisation et l'infiltration des cellules immunitaires du sang dans le cerveau. En résumé, ces tests ex vivo ne suffisent pas à eux seuls. Pour une compréhension complète de la réaction immunitaire face à une greffe de neurones, il est essentiel de combiner des tests in vitro à des expériences réalisées sur des modèles animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés par groupe a été défini comme le minimum nécessaire pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Nous suivons un arbre décisionnel dépendant de résultats d’étapes intermédiaires du projet afin de restreindre les expériences aux seules nécessaires, tout en évitant les répétitions superflues. L'approche statistique proposée dans le cadre de cette étude s'appuie sur les résultats antérieurs que nous avons obtenus, ainsi que nos collaborateurs et d'autres groupes de recherche sur ce domaine.

Raffinement

Pour ce type d'étude, soit une unique opération soit deux opérations distinctes sont nécessaires : pour créer une petite lésion dans une zone du cerveau, et 10 minutes ou une semaine plus tard, pour injecter les cellules que nous étudions. Afin de réduire au maximum le stress et les effets de l'anesthésie sur les animaux, nous prévoyons de tester une méthode qui combine ces deux étapes en une seule opération chirurgicale : injection du produit de lésion, puis des cellules greffées, lors d’une unique chirurgie. Si cette approche unique s'avère négative pour la survie des cellules, nous envisagerons de ne pas injecter le produit de lésion. Si cette deuxième option ne donne pas de bons résultats car l’absence de lésion mimant la lésion nuit de manière trop marquée à la survie des cellules chez les souris, alors nous reviendrons à la méthode classique en deux opérations, espacées de 7 à 30 jours. Dans tous les cas, si des points limites apparaissent après la lésion ou la greffe, les mesures adéquates seront mises en œuvre. Une analgésie est prévue lors interventions si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal classiquement utilisé dans la littérature pour ce type d'expérimentation sur le rejet immunitaire. Nous utiliserons des lignées de souris (dotées d'un système immunitaire fonctionnel) et des lignées de souris génétiquement modifiées pour avoir un système immunitaire déficient, afin de disposer de conditions de contrôle où la survie des greffes cellulaires sans rejet est assurée. L'utilisation de souris adultes nous permettra de valider nos observations dans un système immunitaire qui fonctionne normalement i, ce qui est essentiel pour envisager un développement futur de nos travaux chez l'homme. Comme le préconise la littérature scientifique pour ce type d'expérimentation, les modèles animaux utilisés seront adultes, âgés de plus de 8 semaines, afin que leur système immunitaire soit mature. Autre raison : la maladie de Huntington et le traitement par thérapie cellulaire ne se déclarent et ne sont envisagés que chez l’adulte.

Maintenues éveillées une heure vingt dans un dispositif d'imagerie cérébrale, à deux reprises, 32 souris subissent aussi une chirurgie de trente minutes, six injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, quatre prélèvements de sang à la queue et un jeûne pouvant aller jusqu'à vingt heures. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet cherche à savoir si des changements métaboliques, jeûne ou régime pauvre en sucre, stabilisent l'activité cérébrale altérée dans les troubles liés au stress. Le RNT range l'habituation et les séances d'imagerie en "stress léger", sans dire quelle intervention chirurgicale les souris subissent ni comment elles sont immobilisées pendant une heure vingt d'examen sur animal vigile.

Objectifs

Les troubles liés au stress, comme la dépression, sont souvent accompagnés par des déséquilibres métaboliques. De plus ces troubles sont caractérisés par de l'instabilité dans l’activité du cerveau. Ces troubles peuvent être améliorés par des changement métaboliques, par exemple lors d’un régime spécial ou d’un jeûne. Le but de ce projet est de comprendre comment le métabolisme peut aider à stabiliser l’activité cérébrale

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment les changements métaboliques, en stabilisant l’activité neuronales, peuvent améliorer les troubles liés au stress.

Procédures

6 Injections intrapéritonéales (IP) et 2 sous-cutanées (SC). 1 Chirurgie sous analgésie et anesthésie (30 minutes). Habituation progressive (de 5 minutes à 45 minutes) au dispositif d’imagerie sur 10 jours. 2 séances d’imagerie d’une durée de 1h20 sur animal vigile. 4 prélèvements de sang caudal sur animal vigile. 1 jeune d’une durée maximale de 20 heures.

Impact sur les animaux

Injections : douleur légère de courte durée. Période de récupération post-chirurgie : douleur modérée. Habitation et séance d’imagerie : stress léger. Prélèvement de sang : douleur légère de courte durée. Jeune : stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour préserver leur cerveau et analyse post-mortem

Remplacement

Dans des modèles de culture de cellules nerveuses, on a observé que certaines substances produites par l’organisme lors du jeûne ou d’un régime très pauvre en sucre peuvent soutenir l’activité du cerveau. Cependant, pour comprendre comment ces substances contribuent à stabiliser l’activité cérébrale, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes plus complexes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toute la complexité du cerveau, ce qui rend les études chez l’animal indispensables.

Réduction

Nous menons des études dans lesquelles nous suivons chaque animal au fil du temps. Cela nous permet de comparer son état initial avec les différents stades métaboliques. Cette approche a l’avantage de réduire le nombre d’animaux tout en gardant des résultats fiables. D’après notre expérience, un groupe de 12 animaux est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement solides. Des tests statistiques spécifiques au projet seront utilisés pour l'analyse des résultats.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification (enrichissement). Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux. Des goutes pour les yeux sont appliqués pour prévenir l’assèchement des yeux pendant la chirurgie. Des séances progressives d’habitation au dispositif d’imagerie serons effectué pour réduire le stress.

Choix des espèces

L’imagerie fonctionnelle à ultrason chez l’animal vigile est établie chez la souris. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Chez l’Homme, les troubles liés au stress sont fréquents chez les jeunes adultes des deux sexes. Les animaux seront utilisés entre 6 semaines et 4 mois de vie, ce qui corresponds à ce stade. Les deux sexes sont considérés.

La moitié des 40 souris de ce projet est gavée, une minute par animal, et toutes passent une IRM sous anesthésie gazeuse dont le porteur reconnaît qu'elle expose à une défaillance cardiorespiratoire. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées pour que leur cerveau serve à l'étude de la sénescence cellulaire. Le projet évalue si un médicament déjà testé chez l'humain limite l'atrophie cérébrale d'un modèle du syndrome de Cornelia de Lange, pour lequel aucune piste thérapeutique n'existe. Le porteur mentionne des études du comportement sans en décrire aucune, et affirme que son modèle murin "récapitule parfaitement" le phénotype des patients, dont les comportements auto-agressifs qu'il compte parmi les nuisances du projet.

Objectifs

Le syndrome de Cornelia de Lange (CdLS) est un retard de développement accompagné de malformations du cerveau, du système auditif, du coeur et d’une partie du système digestif. La cause génétique de ce syndrome est une haploinsuffisance du gène Nipbl. Les enfants souffrant de CdLS sont de petite taille, doivent subir des chirurgies réparatrices, ne parlent souvent pas et ont des comportements auto-agressifs. Il n’y a aucune piste thérapeutique. Avec un modèle murin récapitule les symptomes des patients, nous avons trouvé que le syndrome induisait une sénescence (veillissement) embryonnaire programmée exacerbée. Des cellules sénescentes ont été identifiées dans tous les organes au cours du développement y compris dans le cerveau des nouveaux nés. Cette sénescence limite la migration des cellules ce qui est responsable des malformations cardiaques et potentiellement d’un défaut de migration des neurones voire de formation des connections inter neurones. Cette sénescence résulte d’une expression d'un facteur anormalement élevée. Un travail collaboratif a montré qu'un traitement des souris gestantes par un médicament bloqueur de ce facteur permet la naissance de souriceaux de taille normale sans malformation cardiaque et sans cellule sénescente y compris dans le cerveau. Il existe très peu d’études sur les anomalies cérébrales dans ce syndrome. Ces études post-mortem ou par imagerie montrent une atrophie du cerveau . Notre projet étudiera si le traitement des souris au sevrage et au cours de la maturation du cerveau peut limiter la sénescence cérébrale par imagerie in vivo. Cette méthode non invasive et quantitative permettra de faire une analyse du cerveau afin de comparer l’atrophie cérébrale chez des souris CdlS non traitées et traitées. Les anomalies du développement cérébral étant accompagnées de perturbations métaboliques, nous utiliserons une technique d'imagerie adaptée. Ceci permettra d’évaluer l’impact du traitement sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Un effet positif du traitement sur les neurones impactant le développement et ou la maturation du cerveau serait un atout majeur et permettrait d’apporter pour la première fois une piste thérapeutique pour les patients qui n’en ont aucune jusqu’ aujourdh’ui. Ce projet ouvrirait les discussions avec les cliniciens qui s’occupent des enfants affectés par le syndrome quant à un médicament possible pour soulager certains symptômes neurologiques des enfants CdLS. Les méthodes IRM/SRM étant transversales, toute avancée dans la description du modèle pourrait potentiellement être utile au suivi neurologique des patients.

Procédures

20 souris seront gavées ; le protocole ne prend qu' une minute par souris

Impact sur les animaux

1. Le phénotype des souris modèles du syndrome de Cornelia de Lange est potentiellement une nuisance; elles souffrent des mêmes symptômes que les patients , notamment des problèmes neurologiques ( agressivité). Un enrichissement accru des cages estdonc prévu. 2. La prise du médicament validé en essai clinique humain et par nos experiences passées chez la souris comme n'ayant aucune toxicité par gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiquée par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend qu'une minute. 3. Examen clinique par IRM sous anesthésie gazeuse : la seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l' isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Tous les animaux ayant été monitorés en études du comportement puis en IRM seront mis à mort pour prélèvement du cervaeau et étude de la sénéscence cellulaire au sein de ce dernier

Remplacement

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de l’impact de la délétion de Nipbl sur le développement cérébral et l’éventuelle correction de ces anomalies par le traitement necessite de recourir à l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par les organoides qui ne peuvent rendre compte du développement, de la maturation et du fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau. Il n’existe pas non plus de modèle informatique de la maladie.

Réduction

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le nombre de souris a été calculé au plus juste en fonction des génotypes souhaités au moment des croisements tout en veillant à la significativité statistique des données obtenues y compris après calcul d 'une puissance statistique.

Raffinement

Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Les animaux étant hébergées dans le même bâtiment que celui où sera réalisé l’imagerie, le délai d’acclimatation ne sera que de 2 à 3 jours. Une habituation à l'expérimentateur sera assurée lors de l’arrivée des animaux. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitorage physiologique continu (t° rectale, respiration) avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure . Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées aux examens IRM.

Choix des espèces

La souris peut être facilement modifiée génétiquement. Notre modèle murin récapitule parfaitement le phenotype des patients. Elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour une pathologie du développement. Les stades "nouveaux nés et adultes post-sevrage" été choisis en pensant à la clinique humaine où il ne sera possible de traiter que de très jeunes bébés et enfants après leur naissance.

Comprendre comment des zones profondes du cerveau commandent le mouvement et la décision : six macaques rhésus sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Chacun subit jusqu'à six chirurgies de six heures pour poser des implants crâniens, jusqu'à dix séances d'IRM de quatre heures sous anesthésie, et des sessions quotidiennes allant jusqu'à cinq heures pendant lesquelles de fines électrodes sont insérées dans son cerveau. Le porteur maintient les animaux sous contrôle alimentaire pour "maximiser" leur motivation, et décrit cet accès restreint à la nourriture comme un "levier motivationnel". Deux macaques seront tués pour analyse du cerveau, les quatre autres passant à un projet suivant ou, si leur état le permet, placés en sanctuaire.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines zones profondes de notre cerveau nous permettent de contrôler nos mouvements et de prendre des décisions. Pour comprendre leur rôle exact, nous réaliserons des enregistrements et des stimulations au niveau du cerveau chez le singe macaque, dont le cerveau est très proche du nôtre. L’objectif sera de corréler ces enregistrements et stimulations avec le comportement de l'animal afin de comprendre le lien de cause à effet entre l'activité des neurones des zones étudiées et les actions. Mieux comprendre le fonctionnement normal de ces circuits est une étape essentielle avant de pouvoir comprendre ce qui ne va pas dans certaines maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera surtout des connaissances nouvelles et fondamentales sur le fonctionnement normal de notre cerveau. À court terme il pourrait permettre d’avoir une image beaucoup plus précise du rôle exact joué par une zone spécifique du cerveau dans le contrôle de nos actions et décisions. Il pourrait ainsi être possible de dire comment ces zones spécifiques contribuent à préparer, choisir, démarrer ou exécuter un mouvement. Obtenir ces informations détaillées chez le singe est très important car son cerveau ressemble beaucoup au nôtre et pourrait donc fournir des données cruciales pour l’identification des dysfonctionnements observés dans certaines pathologiques neurologiques. En effet, à plus long terme ce projet contribuera à obtenir une meilleure compréhension de la manière dont ces circuits fonctionnent normalement, ceci constituera la première étape indispensable pour ensuite comprendre pourquoi ils dysfonctionnent dans certaines maladies du cerveau qui affectent les mouvements ou les décisions (comme la maladie de Parkinson, les troubles obsessionnels compulsifs, les addictions...). Ces connaissances fondamentales pourraient, un jour, aider à développer de nouvelles pistes pour des traitements ou à améliorer les thérapies existantes comme la stimulation cérébrale profonde.

Procédures

Les singes seront d'abord entraînés à réaliser des exercices d’interactions avec l’écran. Ces apprentissages peuvent prendre plusieurs mois et seront réalisés à raison de 1 à 5h par session, 5 sessions par semaine sur toute la durée du projet. L’animal est en contrôle alimentaire pendant la durée de ces sessions pour maximiser sa motivation et le nombre d’essai réalisé Une fois entrainés les animaux auront 2 chirurgies sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour mettre en place deux implants sur leur tête (6 heures maximum) avec 3 semaines de récupération minimum entre chaque chirurgie. Ces interventions pourront être renouvelées en cas de perte des implants et avec l’accord du vétérinaire (6 chirurgies au total maximum). Avant et après les chirurgies, ils auront une imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale, ces imageries seront répétées après les premiers enregistrements neurophysiologiques et chaque année pour vérifier l’intégrité des tissus et implants (4heures maximum par imagerie, 10 imageries maximum). Après la première chirurgie, pendant plusieurs mois, lors de sessions quotidiennes de quelques heures (5 jours par semaine maximum, 5h maximum par session), de fines électrodes seront insérées temporairement au niveau du cerveau pour mesurer l'activité des neurones pendant que l'animal vigile réalise les exercices. L’animal sera aussi sous contrôle alimentaire pour augmenter sa motivation. Son dispositif d’enregistrement sera nettoyé avant et après chaque séance (animal vigile, acte indolore, 15 minutes environ). Une dernière intervention sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera faite pour injecter un composé au niveau du cerveau nous permettant de modifier génétiquement certaines cellules nerveuses spécifiques (durée 6h maximum). Après cette chirurgie et un temps d'attente entre un et deux mois, des sessions similaires à l’enregistrement de l’activité des neurones auront lieu, mais cette fois une fibre optique sera insérée pour envoyer de la lumière dans le cerveau et activer ou inhiber les cellules nerveuses modifiées. Une partie des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem d’intérêt. Les autres animaux seront gardés en vie pour une utilisation continue ou pour être replacés dans un centre d’accueil.

Impact sur les animaux

L'entraînement aux tâches comportementales et le maintien de la tête au cours de ces tâches génèrera un stress et un inconfort pour l’animal pendant une durée propre à chaque animal (généralement inférieur à une semaine). L'accès contrôlé à la nourriture pourra créer une légère faim, un risque de perte ou de prise de poids et un stress pour l’animal. Les opérations chirurgicales comportent un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. Les implants crâniens génèreront un inconfort, seront associés à un risque d’infection et un risque de perte suite à un rejet du matériel. L'injection dans le cerveau peut causer une petite inflammation locale. Les anesthésies générales nécessaires pour les chirurgies et les imageries génèreront un stress pour l’animal à l’induction et seront associées à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiorespiratoires. La stimulation par la fibre optique peut causer un échauffement local extrêmement léger et modifier temporairement le comportement de l'animal (c'est le but de l'étude), ces effets sont temporaires et limités à la durée de la stimulation, mais pourraient éventuellement être associés à un stress ou léger inconfort pour l’animal.

Devenir

Sur les 6 macaques, 2 seront euthanasiés à la fin du projet pour pouvoir analyser précisément leur cerveau afin de répondre à nos objectifs scientifiques. Pour les 4 autres animaux, soit nous les mettrons en utilisation continue dans un futur projet, soit nous chercherons activement à les replacer dans des structures d'accueil spécialisées (sanctuaires ou centres agréés) pour leur retraite, à condition que leur état de santé et leur comportement le permettent (après évaluation vétérinaire). Notre objectif étant de ne pas euthanasier les animaux quand ce n'est pas indispensable pour les vérifications scientifiques finales.

Remplacement

Pour comprendre comment des circuits précis du cerveau contrôlent nos actions et décisions, et pour tester si l'activité de ces circuits est bien la cause des comportements observés, il faut étudier le cerveau en fonctionnement dans un organisme entier. Les méthodes alternatives (cellules en culture, ordinateurs) ne peuvent pas reproduire cette complexité. L'enregistrement direct de l'activité des neurones (électrophysiologie) et leur manipulation ciblée (optogénétique) pendant que l'animal réalise une tâche nécessitent un animal vivant. Le singe est choisi car son cerveau est le plus similaire à celui de l'homme parmi les animaux de laboratoire, rendant les résultats plus pertinents. Les techniques d'imagerie chez l'homme ne sont pas assez précises pour répondre à nos questions. L'utilisation de singes est donc indispensable ici.

Réduction

Nous utiliserons un maximum de 6 singes sur 5 ans. Ce nombre est le minimum nécessaire pour étudier les deux zones cérébrales d’intérêt avec 3 animaux pour chaque zone, ce qui permet des analyses statistiques fiables. Chaque animal participera à toutes les étapes, ce qui maximise les informations obtenues par animal et réduit le nombre total nécessaire. Seuls 2 animaux sur 6 seront euthanasiés pour des analyses post-mortem nécessaires pour répondre à nos objectifs scientifiques, les 4 autres étant destinés à l’utilisation continue ou au replacement. Nous partagerons les tissus des animaux euthanasiés afin de participer à réduire de manière plus globale le nombre de macaques utilisés à des fins scientifique. Si nous obtenons des résultats clairs plus tôt, nous arrêterons le projet avec moins d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation de 2 semaines avant d’entrer en procédure. Ils auront ensuite un entrainement progressif adapté au rythme de chaque animal et réalisé par renforcement positif. Ainsi, l’animal recevra une récompense (nourriture) à chaque comportement attendu durant l’entrainement, pour renforcer la fréquence de ce comportement. Un écran tactile sera fourni en cage pour débuter l’entrainement de manière volontaire avant qu’ils ne soient amenés dans le box de travail. Afin d’obtenir un levier motivationnel pour les tâches plus complexes nous mettrons en place un contrôle de la distribution des aliments, nous suivrons de manière rigoureuse et quotidienne l’équivalent énergétique fourni à l’animal pour nous assurer de couvrir ses besoins journaliers. L’animal sera également pesé chaque jour d’entrainement pour suivre sa courbe de poids et détecter toute variation liée au contrôle. Une diversification de l’apport alimentaire sera mise en place pour fournir des aliments pauvres en calories permettant d’augmenter le temps de disponibilité de nourriture sans influer significativement sur l’apport énergétique fourni à l’animal. Les chirurgies seront optimisées (neuro-navigation, équipe experte et matériel de qualité) et réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée et un suivi post-opératoire de plusieurs jours. Un suivi quotidien rigoureux (comportement et état général) sera assuré tout au long du projet par du personnel qualifié et le vétérinaire. En cas d’anomalie observée un avis vétérinaire sera demandé pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites précis et précoces sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. En amont de l'implantation du matériel sur le crâne de l’animal, nous réaliserons une IRM pour localiser précisément les sites d’implantation et d’injection, nous permettant d’optimiser l’implantation et les enregistrements ou stimulations qui seront ensuite réalisés. Les enregistrements de l’activité du cerveau et les stimulations lumineuses seront réalisés via l’implant mis en place et ne nécessiteront donc pas de chirurgie supplémentaire pour l’animal et pourront être réalisés en état vigile (actes non douloureux) grâce à l’entrainement des animaux. Pour la stimulation lumineuse nous utiliserons des paramètres rigoureusement contrôlés pour minimiser l'échauffement tissulaire et surveillerons attentivement les effets comportementaux induits.

Choix des espèces

Nous utilisons des singes macaques rhésus (ou éventuellement cynomolgus en l’absence de rhésus disponible) car leur cerveau, notamment les zones cérébrales qui contrôlent les mouvements et les décisions, est très similaire à celui de l'homme. Cette ressemblance est cruciale pour que nos découvertes sur le fonctionnement de ces circuits soient utiles pour comprendre le cerveau humain. Ces singes peuvent apprendre les tâches complexes nécessaires et les techniques d'enregistrement et de stimulation cérébrales nécessaires dans ce projet sont bien maîtrisées chez eux. Nous utilisons des animaux adultes (3 à 16 ans). À cet âge, ils apprennent bien les tâches, s'adaptent bien à la vie en groupe (important pour leur bien-être), et cela permet d'étudier leur cerveau avant les effets du vieillissement. Cela facilite aussi leur replacement éventuel en fin de projet.

Pour mesurer l'effet de composés candidats sur la mémoire, 300 souris et 300 rats sains reçoivent des électrodes implantées dans l'hippocampe ou le cortex préfrontal au cours d'une chirurgie de deux heures. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, le sang terminal étant prélevé au sinus rétro-orbitaire. Les administrations vont jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 injections intrapéritonéales par animal, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins. Les composés testés ont déjà été évalués in vitro par les clients du porteur, ce projet constituant l'étape suivante d'une prestation commerciale.

Objectifs

La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.

Procédures

Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo réalisés sur animal vigile, dans leur cage habituelle, limitent considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.